豇豆属作物远缘杂交研究进展

戴希刚，郭瑞，陈禅友

（江汉大学生命科学学院/湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，武汉，430056）

豇豆属（Vigna）作物属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionaceae），在我国栽培和食用历史悠久，全世界许多国家也普遍种植。我国豇豆属作物 主要有豇豆（V.unguiculata）、绿豆（Vigna radiate）、饭豆（V.umbellata）、小豆（V.angularis）和黑吉豆（V.mungo）等，其中栽培面积较大的主要是豇豆、绿豆和小豆[1]。目前，这些豇豆属作物的育种还停留在传统育种阶段，育种进程均较缓慢。如在豇豆的育种上，国外目前的工作重点主要放在从豇豆种质中筛选抗病虫资源，该方法由于备选种质遗传多样性低，基因库小，因此限制了筛选范围[2]。要在较短时间里培育出符合目标性状的豇豆属新品种，需要有丰富的可供选择的基因资源材料。豇豆属具备丰富的野生种质资源，其中有些资源具有抗病虫的优良特性[3～5]，可以直接应用于豇豆属抗病虫育种工作。本文详细介绍了国内外豇豆属种质资源及豇豆属远缘种间杂交的研究进展，为豇豆属作物的育种工作提供参考。

1 豇豆属遗传资源

豇豆属包括Ceratotropis，Haydonia，Lasiospron，Macrorhyncha，Plectotropis，Sigmoidotropis和Vigna7个亚属[6]，其中只有Vigna,Ceratotropis和Plectotropis3个亚属有栽培种[7]。

Vigna亚属有毛豇豆、长叶豇豆、狭叶豇豆、卷毛豇豆、滨豇豆、野豇豆、乌头叶豇豆、细茎豇豆、琉球豇豆、黑种豇豆、三裂叶豇豆等。Ceratotropis亚属由于主要分布在亚洲，也被称为亚洲豇豆亚属，主要栽培种有绿豆、饭豆、小豆、黑吉豆、乌头叶菜豆等[4]。

2 远缘杂交的意义

远缘杂交可以打破种属间的生殖隔离，将两个或多个物种经过长期进化积累起来的有益特性重新组合，以形成具备抗病、抗虫、抗逆性强、优质等性状的新类型和新品种。因此，远缘杂交育种在创造植物新性状、新类型、新品种方面有重大意义。通过研究这些新品种，不仅可以了解物种的进化史，明晰物种间的亲缘关系，建立分类系统，而且还能指导人工控制新品种形成，更有利于获得具有良好综合性状的新种。同时，利用远缘杂交创造的杂交后代群体，结合品种间的杂交后代群体，可以构建相应种群的遗传图谱[8，9]，并进行基因和基因组作图。因此，远缘杂交在物种的起源、进化、发育、引种、遗传等生物学问题的研究上，也具有重要的理论意义。近几十年来，远缘杂交已被广泛应用于作物育种中，并创造了一些优良品种[10～13]。

3 豇豆属远缘杂交

3.1 远缘杂交的亲和性

远缘杂交亲和性如何，杂种能否正常发育，杂种是否可育以及能否去除不利性状的连锁，这些都是育种者最关心的问题，也正是它们限制了远缘杂交在作物育种中的应用[14]。豇豆属种间杂交的研究表明，在不同亚属间不能获得可存活的杂交后代[15]，Barone等[16]的研究表明，豇豆种和其近缘种之间存在较大的生殖障碍，而豇豆种亚种间的生殖障碍却较低[17，18]。Chen 等[19]对绿豆（V.radiata）、黑吉豆（V.mungo）、饭豆（V.umbelluta）和小豆（V.angularis）四种豇豆属作物进行了远缘杂交研究，在绿豆×黑吉豆、绿豆×饭豆和黑吉豆×小豆的种间杂交上获得了可育种子。另外发现，利用种内杂种作亲本要比利用栽培品种作亲本进行种间远缘杂交的效果好，在绿豆与饭豆的杂交上，利用种内杂种作亲本进行远缘杂交大大提高了结实率；正反交的结荚率差异达到了极显著水平。双亲的基因型不仅影响种间杂种苗的生长，同时也影响其育性。绿豆×饭豆、绿豆×小豆和黑吉豆×小豆的种间杂种完全不育，而绿豆×黑吉豆、饭豆×小豆和小豆×饭豆的种间杂种育性明显减弱。

3.2 幼胚培养

豇豆属作物的远缘杂交失败的原因通常有两个[19，20]，一个是由于花粉管不能正常穿过花柱、柱头，另一个是由于受精后胚败育，后者是常见原因。Barone等[16]也得到了相似结论，他们在野豇豆（V.vexillata）与豇豆（V.unguiculata）的种间杂交研究中正反交均未能获得杂交种子，研究表明存在两个不同的杂交生殖障碍：受精前生殖隔离和受精后生殖隔离。如果我们从授粉后的幼荚中剥离出幼胚，然后进行组织培养，就有可能打破这种障碍从而获得杂种植株[8，21]，因此，幼胚培养可以为远缘杂交获得杂种后代提供技术支撑。

Chen等[19]通过胚培养获得了绿豆×小豆、饭豆×小豆和小豆×饭豆的杂种植株。Chen等[22]通过将幼胚培养获得的胚性愈伤组织再生获得了绿豆 （2n=22）与四倍体V.glabrescens（2n=44）的种间正反交杂种植株，该杂种经自交后几乎不育，但是与二倍体亲本回交后可以正常结实，能获得大量的自交种子。Fatokun等[23]通过胚拯救技术获得了豇豆与多毛野生近缘种V.pubescens的种间杂种，F1表现出植株生长健壮、部分不育、稍微有毛、及其他两亲本的中间特性。

3.3 胚培养方法

Gomathinayagam 等[24]对野豇豆（V.vexillata）与豇豆（V.unguiculata）进行了种间杂交研究。播种时每隔两周重复播种3次，以使花期相遇。授粉采取正反交，授粉10～12 d后收集豆荚，消毒后利用体视显微镜剥离心形期幼胚，将野豇豆×豇豆的幼胚接种到MS+2 mg/L 2，4-D培养基上培养获得了胚性愈伤组织。将愈伤组织接种到MS+2 mg/L BAP（6-苄氨基嘌呤）+40 mg/L腺嘌呤硫酸盐+500 mg/L CH（水解酪蛋白）+10%豇豆嫩荚浸提液（100 g嫩荚加入250 mL水搅拌后3 000 r/min离心5 min）的培养基上获得了13个再生植株。杂种植株表现出双亲的中间形态特征，并遗传了野豇豆的茎叶荚多毛的特性，从而可以抵抗病原的侵害。Tyagi等[25]利用离体培养技术也成功获得了绿豆和豇豆的杂交种，他们将豆荚用赤霉酸持续处理9～10 d，然后再进行胚培养，约10%的胚胎培养成苗。

3.4 胚培养时间

Gosal等[26]通过幼胚培养获得了黑吉豆（V.mungo）与绿豆（V.radiata）的种间杂种，分离授粉后 11～17 d的幼胚，接种于MS+IAA+KT（呋喃腺嘌呤）+CH（或椰子汁）可形成正常植株，小于11 d的幼胚会形成愈伤组织或白化、细长、柔弱的植株。Siriwardhane等[20]的研究认为，豇豆属作物之间的遗传差异往往导致不同种间杂交时幼胚败育，他们发现当幼荚长到10 d左右幼胚便出现败育，因此，要想得到杂交后代植株，只有在种子败育前进行幼胚培养。Barone等[16]的研究发现，豇豆与野豇豆种间杂交后，花粉管发育异常导致受精率减少，仅有18%～30%受精，杂交胚发育过程中胚和胚乳核总是在授粉后5～8 d败育，胚在发育到球形阶段就停止生长，而处于此早期阶段的胚还不能剥离幼胚进行胚拯救。

3.5 桥梁亲本的利用

对于那些远缘杂交亲和性较差的豇豆属作物，可以利用亲缘关系与两亲本较近的第三个种作为桥梁，起到性媒介的作用。研究表明，桥梁作物可以克服远缘杂交的不亲和性。Siriwardhane等[20]证实小豆近缘野生种V.riukiuensis均可和饭豆、小豆杂交获得可育杂种，因此，V.riukiuensis可作为桥梁作物将饭豆中的某些抗虫基因转到小豆中去。Tomooka等[4]的研究也证实小豆近缘野生种V.minima、V.nakashimae也可作为饭豆和小豆间的桥梁作物，从而扩大了桥梁作物的选择范围。日本育种学者Peerasak等[27]已经利用桥梁亲本，将抗豆象基因从饭豆转移到了小豆中，创新了小豆种质资源。Gupta等[28]以绿豆与黑吉豆远缘杂交种作为桥梁与小豆进行了杂交试验，获得了1粒可育的杂交种，这说明应用桥梁亲本可以将小豆高产、抗病等优良性状转移到黑吉豆、绿豆中去，也可以将绿豆、黑吉豆、小豆3种作物的优良性状集中到一种基因型中，拓宽种质遗传基础。

4 豇豆属远缘杂交的应用

Fujii等[3]在进行豇豆属食用豆类抗豆象研究时发现了一份抗豆象的野生绿豆 （V.radiatavar.sublobata）资源——TC1966，这对于豇豆属抗豆象育种研究具有非常重要的作用，之后研究者们针对这份抗豆象种质展开了一系列的相关研究[29～32]。20世纪90年代，泰国科学家通过远缘杂交成功地将野生绿豆资源的抗豆象基因转育到了栽培绿豆资源中，创造了具备突出抗豆象特性的优异绿豆资源[33]；中国科学家利用上述材料进而创新出农艺性状和抗豆象性均突出的优异资源。1994年，杨人俊等[34]将野生小豆与栽培小豆进行正反杂交试验，结果都获得了杂交后代。Peerasak等[27]利用远缘杂交技术成功地将抗豆象基因从饭豆转移到了小豆中，育成了性状优良的抗豆象小豆资源，抗性程度达100%。Kaga等[8]通过小豆与饭豆远缘杂交，通过幼胚培养获得了杂种后代，利用F2群体构建了一张包括14个连锁群的小豆-饭豆遗传连锁图谱，为小豆的基因挖掘，QTL定位等奠定了基础。赵凤梧等[35]曾尝试将棉花与豇豆进行远缘杂交，试图将豇豆的优异基因（如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因）导入棉花中，开启了利用科间远缘杂交技术转移豇豆属作物优异基因的试探。

5 小结

中国是绿豆和小豆的起源地之一，全国多地都有绿豆、小豆的野生种及近缘野生种的分布，其中很多野生资源具有抗虫、抗病等优良性状[1]。饭豆在我国也广为分布，能在炎热和潮湿的贫瘠土壤中生存，具有产量高[36]、抗豆象[37，38]、抗黄花叶病毒病[39]和细菌性叶斑病[40]等优良性状。近年来，豇豆病虫害问题日益严重，豇豆栽培农药残留事件屡见不鲜，因此，寻找抗病虫豇豆资源，培育抗病虫豇豆品种成为豇豆育种的新兴课题。利用豇豆与绿豆、小豆、饭豆种间杂交将绿豆、小豆、饭豆的抗病虫害基因导入豇豆中，从而创新豇豆种质显得前景广阔。

对于豇豆属作物研究者来说，应大量收集豇豆属栽培及野生种质资源，并对其各项农艺性状进行鉴定、评价，筛选出优异资源，用以开展豇豆属远缘杂交育种研究，或利用作图群体构建遗传连锁图谱，开展豇豆属近缘种的比较基因组学研究，同时对重要农艺性状进行基因定位，挖掘优异变种，为开展分子标记辅助选择育种奠定基础。

[1]刘长友，田静，范保杰，等.豇豆属3种主要食用豆类的抗豆象育种研究进展[J].中国农业科学，2010，43（12）：2 410-2 417.

[2]何礼.我国栽培豇豆的遗传多样性研究及其育种策略的探讨[D].成都：四川大学，2002.

[3]Fujii K,Miyazaki S.Infestation resistance of wild legumes(Vigna sublobata)to azuki bean weevil,Callosobruchus chinensis(L.)(Coleoptera:Bruchidae)and its relationship with cytogenetic classification[J].Applied Entomology and Zoology,1987,22(2):229-230.

[4]Tomooka N,Kashiwaba K,Vaughan D A,et al.The effectiveness of evaluating wild species:searching for sources of resistance to bruchid beetles in the genusVignasubgenusCeratotropis[J].Euphytica,2000,115:27-41.

[5]Kashiwaba K,Tomooka N,Kaga A,et al.Characterization of resistance to three bruchid species(Callosobruchusspp.,Coleoptera,Bruchidae)in cultivated rice bean (Vigna umbellata)[J].Journal of Economic Entomology,2003,96(1):207-213.

[6]Maréchal R,Mascherpa J M,Stainier F.Etude taxonomique d'un groupe complexe d'espèces des genres Phaseolus etVigna(Papilionaceae)sur la base de données morphologiques et polliniques,traitées par l'analyse informatique[J].Boissiera,1978,28:1-273.

[7]Doi K,Kaga A,Tomooka N,et al.Molecular phylogeny of genusVignasubgenusCeratotropisbased on rDNA ITS and atpB-rbcL intergenic spacer of cpDNA sequences[J].Genetica,2002,114(2):129-145.

[8]Kaga A,Ishii T,Tsukimoto K,et al.Comparative molecular mapping inCeratotropisspecies using an interspecific cross between azuki bean(Vigna angularis)and rice bean(V.umbellata)[J].Theoretical and Applied Genetics,2000,100(2):207-213.

[9]Lambert P,Hagen L S，Arus P,et al.Genetic linkage maps of two apricot cultivars (Prunus armeniacaL.)compared with the almond Texas×peach Earlygold reference map forPrunus[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,108:1 120-1 130.

[10]郑殿升，盛锦山.主要作物远缘杂交概况[J].植物遗传资源科学，2002，3（1）：55-60.

[11]刘后利.油菜遗传育种学[M].北京：中国农业大学出版社，2000.

[12]张成敏，孙卫邦，张石宝，等.四季秋海棠与球根秋海棠远缘杂种——樱桃海棠[J].园艺学报，2001，28（1）：83-85.

[13]曾烨，牟蕴慧，甄灿福，等.李、杏远缘杂交种的创造及其利用研究[J].北方园艺，2000（6）：22-23.

[14]徐宁，王明海，包淑英，等.小豆远缘杂交研究进展[J].植物遗传资源学报，2010，11（6）：666-670.

[15]Dana S,Karmakar P G.Species relation inVignasubgenusCeratotropisand its implication in breeding[J].Plant Breeding Reviews,1990,8:19-42.

[16]Barone A,Giudice A D,Ng N Q.Barriers to interspecific hybridization betweenVigna unguiculataandVigna vexillata[J].Sexual Plant Reproduction,1992,5:195-200.

[17]Sakupwanya S,Mithen R,Mutangandura-Mhlanga T.Studies on the AfricanVignagenepool II.Hybridization withVigna unguiculatavar.tenuisand var.stenophylla[J].Plant Genetic Research News,1989:78/79:5-9.

[18]Pasquet R S.Genetic relationships among subspecies ofVigna unguiculala(L.)Walp.based on allozyme variation[J].Theoretical and Applied Genetics,1999,98:1 104-1 119.

[19]Chen N C,Baker L R,Honma S.Interspecific crossability among four species ofVignafood legumes[J].Euphytica,1983,32:925-937.

[20]Siriwardhane D,Egawa Y,Tomooka N.Cross-compatibility of cultivated adzuki bean (Vigna angularis)and rice bean (V.umbellata)with their wild relatives[J].Plant Breeding,1991,107(4):320-325.

[21]Ahn C S,Hartmann R W.Interspecific hybridization between rice bean[Vigna umbellata(Thunb.)Ohwi&Ohashi]and adzuki bean[V.angularis(Wi1d)Ohwi&Ohashi][J].Journal of the American Society for Horticulture Science,1978,103(4):435-438.

[22]Chen H K,Mok M C,Shanmugasundaram S,et al.Interspecific hybridization betweenVigna radiata(L.)Wilczek andV.glabrescens[J].Theoretical and Applied Genetics,1989,78(5):641-647.

[23]Fatokun C A,Singh B B.Interspecific hybridization betweenVigna pubescensandV.unquiculata(L.)Walp through embryo rescue[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,1987,9:229-233.

[24]Gomathinayagam P,Ganeshram S,Rathnaswamy R,et al.Interspecific hybridization betweenVigna unguiculata(L.)Walp.andV.vexillata(L.)A.Rich.throughin vitroembryo culture[J].Euphytica,1998,102(2):203-209.

[25]Tyagi D K,Chawla H S.Effects of seasons and hormones on crossability barriers andin vitrohybrid development betweenVigna radiataandVigna unguiculata[J].Acta Agronomica Hungarica,1999,47:147-154.

[26]Gosal S S,Bajaj Y P S.Interspecific hybridization betweenVigna mungoandVigna radiatathrough embryo culture[J].Euphytica,1983,32:129-137.

[27]Peerasak S,Prakit S,Chanida S.Genetics and breeding of resistance to bruchids (Callosobruchusspp.)inVignacrops:A review[J].Naresu University Science Journal,2007,4(1):1-17.

[28]Gupta V P,Plaha P,Rathore P K.Partly fertile interspecific hybrid between a black gram×green gram derivative and an adzuki bean[J].Plant Breeding,2002,121(2):182-183.

[29]Miura K,Ishimoto M,Yamanaka N,et al.Effects of bruchid-resistant mungbean meal on growth and bloodbiochemicalvaluesin mice[J].Japan International Research Center for Agricultural Sciences Journal,1996,3:23-31.

[30]Lambrides C J,Imrie B C.Susceptibility of mungbean varieties to the bruchid speciesCallosobruchus maculatus(F.),C.phaseoli(Gyll.),C.chinensis(L.),andAcanthoscelides obtectus(Say.)(Coleoptera:Chrysomelidae)[J].Australian Journal of Agricultural Research,2000,51(1):85-89.

[31]Somta P,Ammaranan C,Ooi P A C,et al.Inheritance of seed resistance to bruchids in cultivated mungbean(Vigna radiataL.Wilczek)[J].Euphytica,2007,155:47-55.

[32]Somta C,Somta P,Tomooka N,et al.Characterization of new sources of mungbean(Vigna radiata(L.)Wilczek)resistance to bruchids,Callosobruchusspp.(Coleoptera:Bruchidae)[J].Journal of Stored Products Research,2008,44(4):316-321.

[33]宗绪晓，关建平.食用豆类资源创新品种选育进展及发展策略[J].中国农业信息，2008（9）：35-38.

[34]杨人俊，韩亚光.野赤豆在辽宁省的地理分布及其与赤豆间的杂交试验[J].作物学报，1994，20（5）：607-613.

[35]赵凤梧，李慧敏，吴振良，等.棉花、豇豆科间杂交F1生殖器官的异常表现[J].河北农业科学，2006，10（1）：10-13.

[36]Smartt J.Evolution and genetic resources.In:Smartt J.ed.Grain legumes[M].Cambridge:Cambridge University Press,1990：140-175.

[37]Kashiwaba k,Tomooka N,Kaga A,et al.Characterization of resistance to three bruchid species(Callosobruchusspp.,Coleoptera,Bruchidae)in cultivated rice bean(Vigna umbellata)[J].Journal of Economic Entomology,2003,96:207-213.

[38]Somta P,Kaga A,Tomooka N,et al.Development of an interspecificVignalinkage map betweenVigna umbellata(Thunb.)Ohwi&Ohashi andV.nakashimae(Ohwi)Ohwi&Ohashi and its use in analysis of bruchid resistance and comparative genomics[J].Plant Breeding,2006,125:77-84.

[39]Borah H K,Debchoudhury P K,Sheikh I A,et al.Genetic parameters correlations and path analysis among yield and yield characters in ricebean(Vigna umbellata(Thunb.)Ohwi and Ohashi)[J].The Madras Agricultural Journal,2001,88:629-632.

[40]Arora R K,Chandel P S,Joshi B S,et al.Rice bean:tribal pulse of Eastern India[J].Economic Botany,1980,34(3):260-263.