脓毒症大鼠血清miR-9的表达及其意义

杨 炯，李新宇

(1. 解放军第12医院，新疆 疏勒 844200；2. 兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

脓毒症大鼠血清miR-9的表达及其意义

杨 炯1，李新宇2

(1. 解放军第12医院，新疆 疏勒 844200；2. 兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

目的 探讨检测脓毒症大鼠血清中miR-9的表达及其意义。方法 将54只大鼠分为假手术组24只、脓毒症组24只和正常对照组6只。建立盲肠结扎穿孔脓毒症动物模型。检测各组大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和C反应蛋白(CRP)浓度水平，评估脓毒症炎症反应情况；实时荧光定量RT-PCR法检测大鼠血清中miR-9的表达情况；皮尔森相关分析评估血清miR-9的表达与IL-6、TNF-α和CRP之间的关系。结果 脓毒症大鼠血清miR-9的表达水平较正常对照组和假手术组显著升高(P均<0.01)，术后2 h血清miR-9表达即迅速上升达到一个较高水平。皮尔森相关分析结果也显示血清miR-9的表达与IL-6、TNF-α和CRP呈正相关(P均<0.01)。结论 脓毒症大鼠血清miR-9表达显著增高，其水平反映机体炎症反应状态，可以作为脓毒症早期诊断及预后的指标。

脓毒症；血清miR-9；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子α；C反应蛋白

脓毒症是严重创伤、感染及大手术后常见的并发症，可引起脓毒症休克及多脏器功能障碍综合征(MODS)，是临床危重病症最常见的死亡原因[1]。早期诊断脓毒症，准确地评价其病情严重程度和判断预后，及时有效地干预治疗，是降低脓毒症患者病死率的关键。miRNA是近年来发现的一类广泛存在于真核生物中的非编码调控单链小分子RNA，它通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’-untranslated region，3’UTR)完全或不完全互补匹配，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译[2]。最近的研究结果显示miR-9在炎性刺激的白细胞表达升高，提示miR-9基因的表达与炎症反应密切相关[3]。由于miRNA在血清中稳定表达，且其表达谱在疾病状态下出现异常改变，可能成为潜在的疾病检测评估指标及治疗靶点[4-5]。故本研究采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒平模型，检测脓毒症大鼠血清miR-9表达改变情况，探讨其在脓毒症中的意义。

1 实验资料

1.1实验动物及分组 清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠54只，体质量200～250 g，购于新疆医科大学动物实验中心。将实验动物随机分为假手术组24只，大鼠麻醉后仅行开腹手术，不行模型诱导；脓毒症组24只，大鼠麻醉后行盲肠结扎穿刺术建立模型；正常对照组6只，大鼠正常饲养，不做任何处理。其中假手术组和脓毒症组按术后2 h、6 h、12 h、24 h分为4个亚组，每组6只。

1.2大鼠脓毒症模型的建立 大鼠术前禁食12 h、禁水4 h。0.3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧于固定台，腹部备皮消毒。于腹正中线行约2 cm的纵向切口，充分暴露盲肠，在盲肠末端距离回盲瓣约5 mm处用3-0丝线结扎。然后用18号针头在结扎处与盲肠末端的1/2处制造贯通穿孔3个，轻轻挤压盲肠使少量盲肠内容物溢出形成盲肠漏。原位回纳盲肠，3-0丝线双层缝合关腹。假手术组在剖腹后暴露并翻动盲肠，但不进行结扎和穿刺。各组术后均按5 mL/100 g体质量皮下注射生理盐水补充手术过程中的液体流失。

1.3大鼠血清的收集 将各组大鼠麻醉后仰卧于固定台。开腹后用10 mL注射器抽取下腔静脉血6～8 mL，分别置入2 mL微量离心管，室温下静置1 h，然后2 000 r/min离心15 min，取上清(血清)置于新1.5 mL微量离心管。将收集的血清样本置于-80 ℃冰箱保存待检测。

1.4血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)的检测 大鼠IL-6、TNF-α、CRP酶联免疫分析试剂盒由上海信然生物技术有限公司提供，实验严格按试剂盒说明进行操作。

1.5血清miR-9的检测 采用Real time RT-PCR法检测miR-9在各组大鼠血清中的表达情况。①总RNA的提取。Trizol法提取血清和组织总RNA。Nanodrop测定RNA浓度并评估纯度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。②miRNA的cDNA合成。制备20 μL RT混合反应液：Total RNA 0.3 μg，dNTP(2.5 mmol/L each)2 μL，10×RT Buffer 2 μL，RT特异引物(1 μmol/L)0.5 μL，MMLV反转录酶(10 IU/μL)2 μL，RNA酶抑制剂(40 IU/μL)0.3 μL。在Gene Amp PCR System 9700进行RT反应：16 ℃，30 min；42 ℃水浴，40 min；85 ℃水浴，5 min反应结束后，冰上冷却5 min，-80 ℃保存。③miR-9及U6引物序列购于上海英骏生物技术有限公司，采用stem-loop进行miRNA逆转录。采用10 μL的反应体系：dNTP(2.5 mmol/L each)1.0 μL，10×PCR缓冲液1.0 μL，MgCl2溶液0.6 μL，Taq聚合酶0.5 IU，Sybergreen I终浓度0.25×，10 μmol/L的PCR特异引物F 0.4 μL，10 μmol/L的PCR特异引物R 0.4 μL，2×ROX Reference Dye 0.2 μL。反应条件：95 ℃，3 min；40个PCR循环(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s)，实验重复3次。以U6 snRNA作为内参，数据采用2-ΔΔCT法进行分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平比较 脓毒症组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP浓度在术后2h即出现明显升高，这种变化在术后6h迅速增大并达到一个较高的水平，此后各时间点IL-6、TNF-α和CRP浓度变化不大。脓毒症大鼠组各时间点IL-6、TNF-α、CRP水平与假手术组相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与本组术后2h比较，P<0.05。

2.2各组大鼠血清miR-9表达情况 正常情况下大鼠血清miR-9维持在一个比较低的水平。脓毒症组大鼠血清miR-9表达水平较正常对照组和假手术组显著升高(P均<0.01)，术后2h血清miR-9表达即迅速上升达到一个较高水平，此后变化幅度减小呈缓慢升高趋势。见图1。

图1 不同时间点各组大鼠血清miR-9表达情况

2.3血清miR-9与IL-6、TNF-α、CRP的相关分析 皮尔森相关分析结果显示，血清miR-9与IL-6、TNF-α、CRP的表达呈明显正相关(r=0.700 9，0.745 7，0.726 3，P均<0.01)。见图2～4。

图2 血清miR-9与IL-6的相关性分析

3 讨 论

脓毒症是严重感染导致炎症反应失控的紊乱状态，包括一系列的神经内分泌学、免疫学和血液学反应。目前对于脓毒症尚缺乏确切的治疗手段，患者往往死于过度炎症反应所致的组织器官损伤和脏器衰竭。因此，对感染和脓毒症及其并发症进行早期诊断和治疗显得尤为重要。近年来发现miRNA可通过转录后水平下调炎症因子和炎症因子信号通路的受体来调控失衡的炎症反应，提示miRNA在脓毒症炎症反应和免疫调控中起到非常重要的作用。更值得关注的是，脓毒症患者血清中miRNA的表达也与正常人不同。

图3 血清miR-9与TNF-α的相关性分析

图4 血清miR-9与CRP的相关性分析

Vasilencu等[6]应用miRNA芯片检测技术对比研究了脓毒症患者和正常人血清中的miRNA表达谱差异情况，结果显示miR-150、miR-182、miR-342-5p和miR-486在2组中差异表达，并且miR-150表达水平同SOFA评分相关，提示miR-150能有效评估脓毒症患者病情的严重程度；进一步研究发现TNF-α、IL-10和IL-18可能为miR-150的下游靶基因。Wang等[7]研究显示，miR-146a和miR-223在脓毒症患者血清中表达减少，其中miR-146a和miR-223显示很高的脓毒症预测价值，具有很高的特异性和敏感性，提示这2种miRNA可以作为脓毒症患者的血清标志物。因此，miRNA可能是一个理想的基于血液的脓毒症检测评估指标及治疗靶点。

最近的研究数据表明，miR-9参与体内多种生理病理过程。Bazzoni等[8]的研究显示，经LPS诱导后，人血液循环中多形核中心粒细胞和单核细胞的miR-9表达水平会明显升高，进一步研究发现这种改变与TLR4的活化有关。此外，研究还发现TLR2和TLR7/8激动剂以及促炎细胞因子TNF-α和IL-1β能够刺激炎症反应细胞miR-9的表达，而通过TLR4活化的NF-κB能迅速升高miR-9来细调NF-κB家族的一个关键分子的表达，从而反馈调节NF-κB从属反应。此外，Zhang等[9]研究发现部分肝切除后大鼠血清中miRNA的表达出现显著升高，且发现白细胞分泌是腹部创伤后早期血清中miR-9的主要来源，提示血清中miRNA-9可能参与调控创伤后炎症反应。以上研究数据显示miR-9在天然免疫应答中起非常重要的作用，能够调控炎症反应。因此，可以认为miR-9可成为脓毒症诊断的血清标记物和治疗的潜在靶点。

本研究显示，脓毒症组大鼠血清miR-9表达水平较正常对照组和假手术组显著升高，且术后2h血清miR-9表达即迅速上升达到一个较高水平并呈继续升高趋势。假手术组miR-9的水平也较正常组升高，但变化幅度远小于脓毒症组。提示血清miR-9可以用于脓毒症的鉴别诊断。为了进一步验证血清miR-9在脓毒症鉴别诊断中的作用，同时检测了实验大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP的浓度水平。IL-6、TNF-α和CRP在机体的炎症反应和免疫调节过程中发挥重要作用。正常情况下，血液循环中IL-6、TNF-α和CRP的浓度很低，炎症反应中IL-6、TNF-α、CRP的浓度可出现明显改变，三者的表达水平与病情程度相关，其生成情况能反映炎症损伤的严重程度[10-12]。本实验中脓毒症大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP浓度较正常对照组和假手术组显著升高，这种变化在术后6h迅速增大并达到一个较高的水平，此后各时间点IL-6、TNF-α和CRP浓度变化不大。皮尔森相关分析结果显示血清miR-9的表达与IL-6、TNF-α和CRP呈明显正相关。表明血清miR-9与IL-6、TNF-α和CRP一样具有评估早期脓毒症的能力。

总之，本实验初步证实了血清miR-9具有诊断和鉴别脓毒症的价值。但是，将miR-9作为临床脓毒症患者病情严重程度及预后的指标，还需要大量的基础和临床试验来进一步验证。此外，由于miR-9在机体的炎症反应和免疫调节过程中的重要作用，也可以通过anti-miRNA寡核苷酸(AMOs)、miRNA海绵、miRNA模拟物(miRNAmimics)等途径调控体内miR-9的表达，可能成为一种治疗脓毒症的新途径[13-14]。

[1]TillotsonGS.Introduction:sepsis[J].Chest,2009,136(5Suppl):e28

[2]FabianMR,SonenbergN,FilipowiczW.RegulationofmRNAtranslationandstabilitybymicroRNAs[J].AnnuRevBiochem,2010,79:351-379

[3]TsitsiouE,LindsayMA.microRNAsandtheimmuneresponse[J].CurrOpinPharmacol,2009,9(4):514-520

[4]ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[J].CellRes,2008,18(10):997-1006

[5]BlondalT,JensbyNS,BakerA,etal.AssessingsampleandmiRNAprofilequalityinserumandplasmaorotherbiofluids[J].Methods,2013,59(1):S1-S6

[6]VasilescuC,RossiS,ShimizuM,etal.MicroRNAfingerprintsidentifymiR-150asaplasmaprognosticmarkerinpatientswithsepsis[J].PLoSOne,2009,4(10):e7405[7] Wang JF,Yu ML,Yu G,et al. Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,394(1):184-188

[8] Bazzoni F,Rossato M,Fabbri M,et al. Induction and regulatory function of miR-9 in human monocytes and neutrophils exposed to proinflammatory signals[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(13):5282-5287

[9] Zhang Y,Liao Y,Wang D,et al. Altered expression levels of miRNAs in serum as sensitive biomarkers for early diagnosis of traumatic injury[J]. J Cell Biochem,2011,112(9):2435-2442

[10] Adams JM,Hauser CJ,Livingston DH,et al. Early trauma polymorphonuclear neutrophil responses to chemokines are associated with development of sepsis,pneumonia,and organ failure[J]. J Trauma,2001,51(3):452-457

[11] Hildebrand F,Pape HC,Krettek C. The importance of cytokines in the posttraumatic inflammatory reaction[J]. Unfallchirurg,2005,108(10):793-794

[12] Dupont C,Rodenbach J,Flachaire E. The value of C-reactive protein for postoperative monitoring of lower limb arthroplasty[J]. Ann Readapt Med Phys,2008,51(5):348-357

[13] Krutzfeldt J,Rajewsky N,Braich R,et al. Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs’[J]. Nature,2005,438(7068):685-689

[14] Weiler J,Hunziker J,Hall J. Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs):ammunition to target miRNAs implicated in human disease?[J]. Gene Ther,2006,13(6):496-502

Detection of miR-9 in serum of septic rats and its significance

YANG Jiong1, LI Xinyu2

(1. The 302nd Hospital of PLA, Shule 844200, Xinjiang, China; 2. Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Region, Urumqi 830000, Xinjiang, China)

Objective It is to investigates the expression of miR-9 in serum of septic rats, as well as its significance. Methods 54 rats were divided into sham group (n=24), sepsis group (n=24) and normal control group (n=6). Animal models of sepsis were established by cecal ligation and puncture. The serum levels of IL-6, TNF-α and CRP were measured in every group to evaluate the severity of sepsis. The expression level of serum miR-9 was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Pearson’s correlation analysis was used to evaluate if the expression of serum miR-9 had correlation with IL-6、TNF-α and CRP. Results Expression level of miR-9 in rats’ serum in sepsis group was significantly higher than that in normal control group and sham group (P<0.01), which was very low under normal condition, was significantly increased at 2 h after CLP. Pearson’s correlation analysis also showed that the level of serum miR-9 had positive correlation with IL-6、TNF-α and CRP(P<0.01). Conclusion The significantly up-regulated expression levels of serum miR-9 in septic rats reflected the situation of inflammatory response, and may be used as a diagnostic and prognostic marker in sepsis.

sepsis; serum miR-9; IL-6; TNF-α; CRP

杨炯，男，副主任医师，研究方向为重症医学基础及临床。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.007

R-332

A

1008-8849(2015)04-0364-04

2014-08-15