珠海市恙虫病东方体基因型研究

肖 寒,方 倩

珠海市恙虫病东方体基因型研究

肖 寒,方 倩

目的 对广东省珠海市恙虫病东方体进行基因分型。方法 予高热期恙虫病患者静脉采血后，立刻床旁小白鼠腹腔接种，待发病后解剖，取其腹壁刮液涂片、吉姆萨染色镜检；以巢式PCR进行恙虫病东方体DNA检测和序列分析，将结果进行同源性分析。结果 床旁小白鼠腹腔接种，腹壁刮液涂片镜检可见紫红色圆形、椭圆形、短杆状恙虫病东方体菌体。10例恙虫病患者进行特异性的巢式PCR扩增，其中6例扩增出目的基因片段，阳性率为60%。将扩得珠海恙虫病东方体基因片段的DNA序列与基因库序列进行比对，发现其与韩国株Yonchon株同源性最高,大于95%，系统进化树显示其与Karp株在同一分支。结论 珠海市为恙虫病的自然疫源地，该地区恙虫病东方体的基因型与Yonchon株最相近。

恙虫病;病原体分离；基因分型

Funded by the projet of Zhuhai Health Bureau (No. 2011077)

恙虫病(Scrub typhus)，又名丛林斑疹伤寒，是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的自然疫源性疾病，鼠类为主要传染源，恙螨为传播媒介[1]。1930年在日本分离出Ot，首次明确了日本为该病自然疫源地[2]。1948年也在我国广州首次分离出病原体。1986年以前我国恙虫病主要流行于海南、广东、浙江、广西、云南、四川、湖南、西藏及台湾等省区；1990年代以来疫区迅速扩展先后在江苏、山西、山东、河南、天津、东北等长江以北地区发现了恙虫病流行[2-3]。由于自然疫源地的地理环境、季节流行特点以及恙虫病东方体基因型不同，各地区的恙虫病流行特征亦不相同[4]。因此本试验通过对广东省珠海市恙虫病病原体分离及对其做基因分型，以便为当地对恙虫病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 Ot病原体分离[5-6]取高热期恙虫病患者外周静脉血液4～6 mL，分别床旁腹腔接种于4只6周龄小白鼠，每只约腹腔接种0.8～1.2 mL的恙虫病患者血液。接种后的小白鼠分笼饲养，每隔约3 h观察一次，观察约2周。在2周以内若有小鼠意外死亡则予以剔除。约接种2周后，小鼠出现蜷缩、弓背、不喜活动、呼吸急促、腹水征等症状为发病。待小鼠发病后或濒临死亡时，予脱颈椎法处死。对小鼠进行无菌解剖后，取其腹腔渗出液、腹壁刮取物等物涂片、吉姆萨染色、镜检。

1.2 巢式PCR法检测恙虫病患者血液标本中的OtDNA

1.2.1 OtDNA提取 使用生工SK8224 DNA提取试剂盒提取恙虫病患者全血标本恙虫病东方体DNA作为模板，针对Ot 56 KD主要表面抗原基因设计引物[7]：第1轮PCR反应引物P1: 5′- TACATTAGCTGCGGGTATGACA-3′P2: 5′- CCAGCATAATTCTTCAACCAAG-3′预计扩增约340 bp 基因片段；第2轮PCR 反应引物P3:5′TAGAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA-3′，P4:5′TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG-3′,由上海生物工程技术有限公司合成。扩增的目的基因片段约180 bp 基因片段。

1.2.2 Ot PCR鉴定 按常规方法从恙虫病患者血液标本中提取DNA作为模板。用巢式PCR鉴定。 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 Ot序列测定及分析 将扩增的基因片段送至上海生工公司进行测序。将上述测序阳性结果与Karp、 Yonchon、Kato、Kawasaki、Kuroki序列进行对比。用DNAstar软件进行读取，用DNAstar软件与各参考株序列进行多重排列、对比并进行同源性分析，同时用DNAstar软件计算一组序列内以及组间基因的进化距离(Evolutionary distances)，采取计算进化的最短长度(minimal evolution)的方法进行系统进化树的同源性分析。

2 结 果

2.1 恙虫病病原体分离 在临床诊断恙虫病[1]高热期患者中，静脉采取血液标本行床旁小鼠腹腔接种。每份血标本腹腔接种4只小白鼠，共计20只。有10只小白鼠出现明显的立克次体血症，表现为：身体蜷缩、弓背，不喜活动、呼吸稍显急促及明显的腹水征等。腹壁刮液后吉姆萨染色，显微镜下可见分离的恙虫病病原体，表现为：成堆分布的圆形或椭圆形、短杆状紫红色颗粒，如图1。

2.2 分子生物学检测 采用巢式PCR对10例已分离出恙虫病立克次体患者的血液标本进行检测。结果6例恙虫病患者血液标本中扩增出目的基因片段，约140 bp， PCR阳性率为60%。

图1 感染Ot的小白鼠腹壁刮液吉姆萨染色镜检

Fig.1 Microscopic examination of Giemsa staining for wiping liquid from abdominal wall of mice infected withOt

M: 1 kb marker.

图2 恙虫病患者血中Ot特异性片段扩增产物琼脂糖电泳图(从左向右依次ZH4、ZH5、ZH7、ZH8、M:1kb marker ZH9、ZH10及健康对照1、健康对照2)

Fig.2 Tsutsugamushi disease in blood of the patients withOtspecific amplification products

2.3 序列测定 将目的基因片段测序，与GenBank的恙虫病东方体国际标准株进行对比。将以上结果进行系统进化树分析，结果如下：韩国株Yonchon型(U19903)与ZH4、ZH5、ZH7、ZH8同源性最高达到95%以上。系统进化树也显示Karp株(M33004)与ZH9、ZH10在同一分支。

3 讨 论

针对该抗原生物学分型得到国际公认的恙虫病东方体有Gilliam、Karp、Kato、TA678、TA686、TA716、TA763、H1877等8个血清型，其中 Karp、Kato、Gilliam 3个血清型作为国际参考株，在我国以Gilliam型为主[1]。恙虫病东方体的型别不同，存在的毒力不同，临床表现的轻重亦有不同。目前对恙虫病病原体的分型方法主要包括：血清学分型与基因分型。赖延东等[8]在国内首次实现Sta56全长抗原的重组表达，并对其初步评价了其替代全细胞纯化抗原应用于免疫学诊断的价值，为进一步研究Sta56抗原蛋白的作用和实现经济的诊断打下一定基础。操敏等[9]对恙虫病东方体Gilliam株56 kD外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。刘运囍等[10]从恙虫病患者皮肤焦痂提取OT-DNA经群引物扩增均阳性，探明了恙虫病患者皮肤焦痂内含有恙虫病东方体DNA，从而证实了患者皮肤焦痂也可以作为分子生物学检测标本。分子生物学诊断技术能在体外将特异性DNA序列进行高效扩增，具有特异、敏感、快速等优点，从而成为鉴定恙虫病东方体的重要方法[11]。尤其PCR方法简单，出结果快，对结果解释的主观因素少，不需提纯，所以一般实验室均可采用[12]。

图3 6株Ot Sta56基因序列进化树分析

由于 Ot表膜蛋白抗原中含量最丰富的是型特异性抗原(Type Special Antigen,TSA)56 kD蛋白，所以Ot型别具有多样性；56 kD蛋白是一种暴露在菌体表面的外膜蛋白具有高度保守和抗原结构的复杂性等特点，其抗原结构的复杂性决定抗原型别多样性,该抗原能同群、型特异性单克隆抗体反应，表明其具有群和型的特异性[5]。Ot在逐步的传播过程中，其基因型别通过不断的演变与进化，最终某基因型成为某地区主要的东方体型别(优势株)。珠海市与广东东部所存在相同的Ot型别，可能是由于两地地理位置较近、两地居民往来频繁、鼠类的流窜导致。本研究对广东省珠海市恙虫病东方体进行基因分型，将扩得的珠海市恙虫病东方体基因片段DNA序列与基因库序列进行比对，发现其与韩国株Yonchon株同源性最高，大于95%，系统进化树显示其与Karp株在同一分支。

本研究通过从恙虫病患者血液中分离恙虫病东方体，进一步证实了珠海市为恙虫病疫源地。因此在地区应积极做好必要的预防措施，以降低本病的发生率。主要包括以下几个方面[13-14]：①做好灭鼠工作以消灭传染源;②消灭恙螨切断传播途径：铲除房屋周围杂草改善居住环境卫生、减少潮湿增加光照等方法消灭恙螨孳生地；③做好个人防护措施以减少发病率：禁止在草坪上坐卧，避免在接近树木及杂草丛等地方晾晒衣物；在流行区进行野外生产活动或游玩时，应穿长裤、长袖以减少皮肤裸露面积；④由于本病目前尚无有效的疫苗可供使用，对因工作或其他原因而不得不进入重疫区的人员，可通过预先服强力霉素等药物达到预感染降低发病率。

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Genotypes of etiology ofOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, China

XIAO Han,FANG Qian

(DepartmentofInfectiousDiseases,theFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zhuhai563003,China)

The genotyping of disease causedOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, Guangdong Province, China was studied. We inoculated them to the abdominal cavity of laboratory rat immediately after collection of the venous blood of patients during febrile period. The autopsy was made after onset of tsutsugamushi disease followed by microscopic examining of the scraping smear of abdominal wall with Wright Giemsa staining. DNA detection and sequence analysis ofOrientiatsutsugamushiwere resorted to nested PCR. Results were administered by homology analysis. Mice inoculated intraperitoneally were found with purplish red circular, oval and short rod strain ofOrientiatsutsugamushiin abdominal wall by scraping smear microscopic examination. Ten cases of tsutsugamushi disease patients were administered with specific nested PCR amplification, 6 out of which were amplified with target gene fragment with 60% of positive rate. By comparing the amplified DNA sequences with sequences of the gene pool, we found that its homology was the highest with the South Korean Yonchon strains for exceeding 95%. The phylogenetic tree showed that it was in the same branch with the Karp strain. Zhuhai City is natural epidemic area of tsutsugamushi disease, and the genotype ofOrientiatsutsugamushiin this area is the most similar with that of Yonchon strain.

tsutsugamushi disease; pathogen separation; genotyping

遵义医学院第五附属(珠海)医院感染科，珠海 563003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.010

R376

A

1002-2694(2015)02-0139-04

2014-03-27；

2014-05-19

珠海市卫生局课题(No.2011077)