粉尘螨Hsp60基因的测序、克隆和原核表达

刘海娟，洪 青，罗晓东，李小敏，丁 雪，沈浩贤，陈代雄

粉尘螨Hsp60基因的测序、克隆和原核表达

刘海娟，洪 青，罗晓东，李小敏，丁 雪，沈浩贤，陈代雄

目的 探索和发现粉尘螨新的变应原组分。方法 以粉尘螨热休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)为研究对象，用简并引物PCR方法扩增出其cDNA片段，并对该片段进行了序列测定和分析。同时，对该基因片段进行了克隆、原核表达。结果与结论 成功确定粉尘螨Hsp60基因片段cDNA序列；构建了pET-28a(+)-Hsp60重组质粒，并在E.coliBL21中得到高效表达。

粉尘螨；Hsp60；基因序列；原核表达

近年来变态反应性疾病的发病率呈不断上升趋势，它已成为全球关注的公共卫生问题[1-4]。尘螨作为一种重要的吸入性变应原在变态反应性疾病的研究中极受重视[5-8]。Voorhorst[9]等在1967年的研究中就已证实粉尘螨和户尘螨可引起支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等多种变态反应性疾病，是室内主要过敏原。而尘螨中包含的引起变态反应的成分—尘螨变应原在研究中一直受到高度关注。并且，随着探索的深入，不断有新的尘螨变应原被识别和发现[10-11]，这极大地加深了人类对尘螨变应原的认识，推动了尘螨过敏性疾病诊断、预防和治疗的进步。为探索和发现粉尘螨新的变应原组分，本课题组在既往研究[12]的基础上，选择粉尘螨热休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)为研究对象，测定和分析了它的cDNA序列，并对该基因片段进行了克隆和原核表达。

1 材料与方法

1.1 粉尘螨 由本实验室培养繁殖，保存于-80 ℃。

1.2 主要材料与试剂 原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存。Trizol Reagent购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒(PrimeScript RT-PCR Kit )、EXTaq 酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 连接酶等购自TaKaRa公司(中国大连)。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化公司。

1.3 方法

1.3.1 粉尘螨总RNA的提取 取粉尘螨300只，加入1mL Trizol匀浆。RNA的提取方法参照Trizol Reagent的说明书进行。

1.3.2 粉尘螨cDNA的合成及PCR扩增 按照PrimeScript RT-PCR Kit的说明书操作，以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA。根据与尘螨相近物种Hsp60蛋白的特征性和保守序列设计简并引物，上游引物为5′-gAT GAACCCnATGGAyyTnAArmGngg-3′，下游引物为5′-agTCACCaAAtCCNGGNGCYTTNAC-―3′(引物由Invitrogen公司合成)。以cDNA为模板PCR扩增Hsp60基因片段，PCR反应条件为94 ℃ 5 min， 94 ℃ 45 s → 60 ℃ 45 s → 72 ℃ 90 s，72℃ 10 min。其中2-4步，共进行30个循环。

1.3.3 测序及氨基酸序列分析 将上述扩增获得的PCR产物送往大连宝生物工程(TaKaRa)公司进行测序。将测序结果和由其编码的氨基酸序列用BLAST软件进行同源性分析，对氨基酸序列进行亲水性区域分析(http://www.expasy.org/)。根据pET-28a(+)质粒的序列图谱，用DNAclub软件确定酶切位点为BamHⅠ、XhoⅠ。

1.3.4 粉尘螨Hsp60基因片段的扩增 根据测序结果设计特异性引物，上游引物为5′-CG GGATCCCCAATGGATTTTAAACGCG-3′，下游引物为5′-CGCTCGAGTCCTGGTGCCT TCACG-3′(下划线为酶切位点)。以上述PCR产物为模板扩增Hsp60基因片段，PCR反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s →56 ℃ 45 s → 72 ℃ 90 s ，72 ℃ 10 min，共进行30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收。

1.3.5 粉尘螨Hsp60基因片段克隆 分别对pET-28a(+)质粒和PCR产物进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，将酶切后的Hsp60基因片段用T4连接酶连接到pET-28a(+)载体上。将连接产物转化进E.coliDH5α中，挑取单菌落提取重组质粒，用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将鉴定后阳性的重组质粒转化入表达菌E.coliBL21，用双酶切和PCR方法对转化后的质粒进行鉴定。

1.3.6 重组质粒的诱导表达与可溶性分析 将含pET-28a(+)-Hsp60的菌液培养至对数生长期，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃,280 r/min, 诱导培养4 h。表达产物经10% SDS-PAGE观察表达情况。表达产物可溶性分析参照Sambrook等[13]介绍的方法进行。

1.3.7 重组蛋白质谱分析 重组蛋白送广州辉俊生物科技有限公司进行质谱鉴定。

2 结 果

2.1 简并引物PCR扩增产物的测序及序列分析 简并引物PCR反应产物的大小约520 bp，其DNA测序结果和由它编码的氨基酸序列(见图1)经同源性分析，结果显示：DNA序列与AchromobacterXylosoxidans热休克蛋白60相似度为86%，氨基酸序列与AdvenellaKashmirensis热休克蛋白60的相似度为93%。生物信息学分析显示：该蛋白序列中存在多个可能与免疫原性有关的亲水区域。

图1 Hsp60的cDNA序列和编码的氨基酸序列

2.2 Hsp60基因片段的PCR扩增 用含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异性引物扩增Hsp60基因片段，结果如图2所示，产物中可见大小基本相符的DNA扩增条带(理论值520 bp)。

Lane M: DNA Marker 2000; Lane 1: PCR products.

图2 粉尘螨Hsp60基因片段PCR结果

Fig.2 PCR amplification ofDermatophagoidesfarinaeHsp60

2.3 基因克隆和重组质粒鉴定 将PCR产物双酶切后克隆到经酶切的质粒pET-28a(+)中，重组子进行PCR和双酶切鉴定，结果如图3所示，可见大小相符的目的DNA条带。

Lane M: DNA Marker 2000; Lane 1: PCR products of recombinant plasmid; Lane 2: Recombinant plasmid digested byBamHⅠandXhoⅠ.

图3 双酶切及PCR鉴定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid

2.4 重组质粒的诱导表达 如图4所示。pET-28a(+)-Hsp60可表达约23 kD大小的融合蛋白条带，与推测值大小相符。

Lane M: Protein marker; Lane 1: Expression products of pET-28a(+);Lane 2: Expression products of pET-28a(+)-Hsp60.

图4 pET-28a(+)-Hsp60表达产物的SDS-PAGE结果

Fig.4 Expression of pET-28a(+)-Hsp60

2.5 重组蛋白的可溶性分析 表达产物经SDS-PAGE，结果如图5所示：重组蛋白在上清和沉淀中均有表达。

Lane M: Protein marker;

Lane 1: The insoluble expression products of pET-28a(+)-Hsp60;

Lane 2: The insoluble expression products of pET-28a(+);

Lane 3: The soluble expression products of pET-28a(+)-Hsp60;

Lane 4: The soluble expression products of pET-28a(+).

图5 pET-28a(+)-Hsp60表达产物的可溶性分析

Fig.5 Soluble analysis of pET-28a(+)-Hsp60 expression product

2.6 重组蛋白质谱分析 质谱分析结果显示：重组蛋白为Hsp60。

3 讨 论

目前，尘螨变应原的筛选方式通常是先建立尘螨cDNA文库，然后以尘螨过敏病人血清为探针，通过对cDNA文库的免疫学筛选来识别和发现新的尘螨变应原[14]。本研究的前期工作是以尘螨过敏病人血清为探针，通过免疫印迹方法对整个粉尘螨蛋白中的所有变应原组分同时进行筛选，然后使用高通量的蛋白组学分析技术同时对反应蛋白条带中的多个蛋白质组分进行识别[12]。在此基础上，本研究选取其中的一个可能的变应原组分—Hsp60，用分子生物学方法进行进一步的分析。研究结果显示：利用简并引物扩增和PCR产物测序首次获得了粉尘螨Hsp60部分cDNA序列，并通过基因克隆和大肠杆菌原核表达技术成功表达出粉尘螨Hsp60(片段)重组蛋白。实践证明这是一种尘螨变应原分析和筛选的有效方法，为新的尘螨变应原的发现提供了一种新的技术线路。

Hsp60是热激蛋白的一种，而热激蛋白是所有原核生物和真核生物在生长发育过程中或受到理化及病理因素刺激时，机体内新合成或表达量增加的一组性质和作用基本相似的蛋白质。热激蛋白可被免疫系统识别，参与抗原的加工和递呈[15]；同时，有证据显示[16-17]：一些寄生虫的HSPs可诱导宿主产生抗体，提示其是一种重要的抗原。且粉尘螨Hsp70已被证实可能是其新的变应原组分[18]。因此，粉尘螨在宿主肺部寄生的过程中，其释放的Hsp60有可能诱导宿主产生免疫应答，甚至激发人体产生超敏反应。但目前还没有关于粉尘螨Hsp60及其变应原作用的报告。因此，本研究结果为对粉尘螨Hsp60进行进一步的分析和研究奠定了基础。

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DermatophagoidesfarinaeHsp60--DNA sequencing,cloning and prokaryotic expression

LIU Hai-juan,HONG Qing,LUO Xiao-dong,LI Xiao-min,DING Xue,SHEN Hao-xian,CHEN Dai-xiong

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

We identified newDermatophagoidesfarinaeallergens by DNA sequencing, cloning and prokaryotic expression of Heat shock protein 60 (Hsp60) fromDermatophagoidesfarinae. With degenerate primer polymerase chain reaction (PCR) to amplify theDermatophagoidesfarinaecDNA, the cDNA fragments of the Hsp60 were abundantly obtained. The cDNA sequence and amino acid sequence encoded by it were detected and analysed. Meanwhile, the Hsp60 gene fragment was cloned into the pet-28a vector and transformed intoE.colifor prokaryotic expression of the Hsp60. In this study, the cDNA sequence ofDermatophagoidesfarinaeHsp60 successfully was determined first, and the Hsp60 expressed inE.coliBL21. Results of this research laid a foundation for further analysis and study ofDermatophagoidesfarinaeHsp60.

Dermatophagoidesfarinae; Hsp60; gene sequence; prokaryotic expression

Chen Dai-xiong, Email: daixiongchen@hotmail.com

陈代雄,Email:daixiongchen@hotmail.com

广州医科大学病原生物学与免疫学教研室，广州 510182

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.013

R384

A

1002-2694(2015)02-0154-04

2014-03-19；

2014-08-16

广东省教育厅科技创新项目(No.2013KJCX0154) 资助

Supported by the grants from the Science Research Foundation from Department of Education of Guangdong Province (No. 2013KJCX0154)