幽门螺杆菌ssDNA适配子的筛选及其应用

黄 震，迟秀文，蒲 荣，束振华，孙俊生，王 前

(1.广东省深圳市龙岗中心医院 518116；2.广东医学院护理学院,广东东莞 523808；3.广东省东莞市第三人民医院 523326；4.南方医科大学南方医院,广州 510515)



·论 著·

幽门螺杆菌ssDNA适配子的筛选及其应用

黄 震1，迟秀文2，蒲 荣3，束振华1，孙俊生1，王 前4△

(1.广东省深圳市龙岗中心医院 518116；2.广东医学院护理学院,广东东莞 523808；3.广东省东莞市第三人民医院 523326；4.南方医科大学南方医院,广州 510515)

目的 通过富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选出与幽门螺杆菌(HP)菌体具有高亲和性适配子，并且利用其检测组织和活体内HP的感染。方法 培养HP细菌，利用SELEX筛选获得HP菌体的适配子。在HP感染患者活检组织验证其结合。结果 从第6轮筛选所得ssDNA中筛选出一条高结合力的适配子命名为HP1，将适配子HP1区别于其他筛选出的适配子，并检测其与幽门螺旋杆菌的亲和力。结论 初步获得了针对HP菌体筛选出高亲和性适配子，为开发HP诊断试剂奠定了基础。

幽门螺杆菌； 配基系统进化技术； 适配子； 诊断

目前幽门螺杆菌(HP)全球范围内感染率高达50%以上，而在我国平均感染率约为59%,且存在着地域差异[1-2]。因此，对其早期快速诊断是治疗的关键。传统的方法主要分为侵入型和非侵入型诊断。鉴于传统检测方法灵敏度、特异度不高、误诊率高等缺点，亟待开发一种能够快速、简便、特异性较高的诊断方法，从而对HP感染进行诊断。本试验选用SELEX是一种成熟的应用到各种靶标筛选的技术，包括金属离子、药物、氨基酸、细胞因子、抗菌药物、全菌体、多肽等，其中蛋白质类靶分子最多[3]。有学者曾报道，以结核分枝杆菌H37Rv的菌体为靶标，筛选获得能够与之特异性结合的ssDNA，该适配子能够用于诊断并阻断H37Rv感染[4]。此外经SELEX筛选获得的特异性结合靶分子的适配子与传统意义上抗体相比，具有相对分子质量小，无抗原性，能够稳定合成，同时便于荧光、生物素等多种修饰等特点，是极具应用前景的新型生物制剂[5]。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 菌株 HP标准菌株NCTC11637由中国疾病控制中心传染病预防控制所提供。

1.1.2 试剂及仪器 引物由上海生物有限公司合成：用于克隆构建的主要试剂BamHI、EcoRI、T4 DNA连接酶等分子生物学试剂购自Fermentas公司；核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司)；紫外透射仪(Bioimaging System 美国UVP公司)；pUC19质粒、DH5a菌由本实验室保存。

1.1.3 随机单链 DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成 随机(ssDNA 文库的构建和引物合成构建了长度为 78 nt的 ssDNA 文库,两端为固定序列,中间40个核苷酸为随机序列,库容量约为 1014～1015。两个引物中分别含有 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ的酶切位点,随机ssDNA 5-GCG GAA TTC AAC AGT CCG AGC C-N40-GGG TCA ATG CGT CAT A-3。引物 1:′5-GCG GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA GTC CGA GCC-3′ (划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点);引物 2:′5-GCG GGA TCC TAT GAC GCA TTG ACC C-3′ (划线部分为BamH Ⅰ酶切位点)。随机 ssDNA文库和引物由上海生物有限公司合成。

1.1.4 标本来源 由深圳市龙岗中心医院消化科内窥镜室提供。其中HP诊断标准为：(1)患者有典型的临床症状；(2)H-E染色检出弯曲螺旋状杆菌；(3)HP培养阳性；(4)快速尿素酶法检测阳性。其中任意两项为阳性均判为阳性。

1.2 方法

1.2.1 HP的培养 布氏培养基加入去离子水800 mL，NaOH 调节pH值至7.7后补充去离子水至1 L，121 ℃高压灭菌20 min。使用时按照体积比5∶1加入胎牛血清和终浓度为20%的葡萄糖。在密闭的生化培养箱中38 ℃培养，氧气∶氮气∶二氧化碳=5∶85∶10。

1.2.2 ssDNA文库及双链 DNA (dsDNA)的扩增 将合成的ssDNA文库扩增为dsDNA文库：10×Taq DNA 聚合酶buffer、单链寡核苷酸文库(0.165 μg/μL)、引物Primer1(25 μmol/L)、引物Primer2(25 μmol/L)、dNTP mix(2.5 mmol/L)、Taq 酶、ddH2O 95 ℃预变性5 min,再进行95 ℃ 36 s,60 ℃ 36 s，72 ℃ 84 s，共15个循环，72 ℃延伸5 min，行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。并以扩增所得 dsDNA文库为模板，下游引物P2不对称扩增出下一轮筛选的 ssDNA 文库。反应条件同上，向PCR 产物中加入1/10体积预冷的3 mol/L的NaAc，混匀后，再向体系中加入2倍体积的冰预冷的无水乙醇，充分混匀后，置于-80 ℃沉淀4 h。

1.2.3 SELEX 筛选 取106cfu HP，加入洁净的EP管中再加入200 μL筛选缓冲液(20 mmol/L HEPES，pH=7.4),37 ℃孵育2 h。5 000 g离心5 min弃去上清液，筛选缓冲液洗涤5次后加入200 L灭菌双蒸水，于95 ℃加热10 min；吸取孔中加热后的双蒸水做常规聚合酶链式反应(PCR)。为了提高筛选适配子的亲和力，采用梯度筛选的方式进行，即前3轮投入106cfu HP，第4～6轮投入104cfu HP；为了提高筛选的特异性，从第2轮筛选开始通过胃黏膜细胞和其他细菌(大肠杆菌、链球菌、肠球菌、乳酸杆菌)进行反向筛选，将第6轮dsDNA库，割胶回收。将dsDNA和空载pUC19用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，用割胶回收DNA片段的方法，纯化回收酶切产物，测定浓度后，进行连接反应置于16 ℃，作用16 h。将连接产物转化至DH5中，挑取单克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。

1.2.4 相对亲合力的检测 (1)不同适配子库与HP的亲和力测定:以每轮的dsDNA库为模板，加入以生物素标记的P1引物扩增出生物素标记的ssDNA适配子库，用筛选缓冲液分散HP 106cfu/mL，37 ℃孵育2 h，按每管20 pmoL。每轮适配子库做3个复孔。筛选缓冲液洗涤ssDNA-HP 3次，每次5 min，加入HRP标记的链酶亲和素(1∶2 000稀释)，每孔100 μL，37 ℃作用45 min，PBST洗涤微孔板3次，每次5 min。加入TMB底物，37 ℃下作用1～3 min,观察颜色变化，然后用2 mol/L浓硫酸终止。用酶标仪读出450 nm波长时的吸光度值。(2) 单克隆适配子库与HP的亲和力测定:以测序鉴定正确的质粒为模板，以生物素标记的P1引物扩增出生物素标记的单个适配子，方法同(1)，不同适配子库与HP的亲和力测定。

1.2.5 对临床标本的检测 (1)适配子HP1检测活检组织中的HP：收集活检组织经临床现有方法诊断为HP感染。共计选择确诊阳性患者27例，反复多次抗菌药物治疗患者18例，男16例，女11例，年龄26～67岁，每例标本分成两份，一份进行临床检测，一份进行适配子免疫组织化学检测。将活检组织标本涂布于洁净的载玻片，固定后，使用FITC标记的适配子HP1与之孵育，37 ℃ 2 h，PBS洗涤除去未结合的FITC标记的适配子3次，每次5 min，在荧光显微镜下观察视野。

2 结 果

2.1 DNA文库及筛选产物的 PCR 扩增 化学合成的起始ssDNA 随机文库,经Klenow片段扩增为dsDNA文库,然后经不对称PCR扩增得到的ssDNA 随机文库，结果显示 dsDNA 库片段大小在 DNA marker分子100 bp附近,与预期片段大小 (78 bp)相符。通过SELEX筛选技术筛选获得特异性结合HP的6轮ssDNA适配子库，将各轮单链适配子库行3%的DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，随着筛选轮数的增高，其条带逐渐集中，说明其起始ssDNA文库中的复杂多样的二级结构，经SELEX筛选后，特异性结合HP靶标的ssDNA二级结构趋于一致的适配子被保留。

2.2 不同轮数适配子库及不同克隆单适配子相对亲合力的检测 将起始文库和筛选的6轮适配子与HP的亲和力进行比较，结果显示第六轮具有最高亲和力(图1A)，考虑到适配子文库的丰富性随将第6轮文库扩增的dsDNA文库克隆至pUC19质粒，转化入DH5α后在经过氨苄青霉素抗性筛选后，挑取单克隆菌落，提取质粒，经酶切鉴定和测序鉴定正确的16个不同序列的单克隆适配子与HP的亲和力比较，结果显示7号适配子具有最高亲和力，将结合力最高的7号适配子命名为HP1(图1B)。

注：A为不同轮数的适配子文库的亲和力的比较；B为不同单克隆适配子的亲和力的比较。

图1 不同轮数适配子文库亲和力及不同单克隆适配子亲和力的比较

2.3 对临床标本的检测 FITC标记的适配子HP1与活检组织中HP特异性结合，在患者活检组织中能够清晰可见短杆状的黄绿色荧光，而在正常组织对照组无荧光。经过对27例患者的活检组织的检出阳性率与HE染色、培养、尿素酶法的比较，结果显示，适配子法有较高的特异性(表1)。

表1 3种方法对HP感染患者的诊断

3 讨 论

HP是一种消化道致病菌，其与胃部疾病密切相关。而目前临床诊断技术存在各种不足[6]。因此，本课题采用SELEX技术筛选与HP具有高亲和力、高特异性结合的ssDNA适配子。核酸适配子是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其相对分子质量较低，没有免疫源性，可通过化学合成制备及结构改造以及荧光、生物素等多种功能标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输，这些优点使适配子在临床诊断及治疗中具有良好的应用前景[7]。

本研究采用SELEX技术经过6轮筛选后，利用ELONA方法比较了各轮适配子库与HP的结合能力，并从亲和力最高的第6轮适配子扩增为双链库并构建到pUC19的载体质粒中筛选出适配子HP1，将其应用于患者活检组织的HP检测中，结果显示适配子HP1能够在复杂的组织标本中特异性的识别结合HP，从而为临床诊断提供依据。而本次研究仍是基于活检组织开展，虽然适配子HP1表现出较高的灵敏度和特异度，但是仍有悖于本研究的初衷，即口服修饰的荧光标记的核酸适配子与HP在体内结合后，提供体外红外荧光检测其是否有HP感染，以及根据荧光强度评判感染的严重程度从而预测HP导致胃部疾病的风险。同时，也有研究表明适配子与靶标菌体的结合能够阻断细菌对宿主细胞的感染。因此，本研究筛选出的适配子HP1对HP侵袭胃黏膜细胞是否发挥作用，也值得进一步探讨。

综上所述，运用SELEX技术成功地筛选到高亲和力及高特异性结合HP的ssDNA适配子，为HP感染所致疾病的鉴别诊断开辟了一条新的途径，具有良好的应用前景。

[1]Pan Q,Wang Q,Sun X,et al.Aptamer against mannose-capped lipoarabinomannan inhibits virulent Mycobacterium tuberculosis infection in mice and rhesus monkeys[J].Mol Ther，2014,22(5):940-951.

[2]Lee YY,Mahendra RS,Graham DY.Helicobacter pylori infection——a boon or a bane:lessons from studies in a low-prevalence population[J].Helicobacter,2013,18(5):338-346.

[3]Ellington AD,Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990,346(6287):818-822.

[4]Chen F,Zhou J,Lou F,et al.Aptamer from whole-bacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2007,357(3):743-748.

[5]Stoltenburg R,Reinemann C,Strehlitz B.SELEX——a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands[J].Biomol Eng,2007,24(4):381-403.

[6]Kim D,Jeong YY,Jon S.A drug-loaded aptamer-gold nanoparticle bioconjugate for combined CT imaging and therapy of prostate cancer[J].ACS Nano,2010,4(7):3689-3896.

[7]Miyakawa S,Fujiwara M,Nakamura Y.Aptamer therapeutics[J].Tanpakushitsu Kakusan Koso,2006,51(16):2521-2527.

Screening and application of ssDNA aptamers of Helicobacter pylori*

HUANGZhen1,CHIXiu-wen2,PURong3,SHUZhen-hua1,SUNJun-sheng1,WANGQian4△

(1.LongangCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518116,China;2.NursingCollege,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China;3.DongguanMunicipalThirdPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523326,China;4.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To screen the high-affinity aptamers of Helicobacter pylori (HP) by systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX) and to apply this technique to detect HP infection in tissue and in vivo.Methods HP was cultured.SELEX was applied to conduct screening for obtaining theaptamers of HP.The aptamers were used to detect the HP infection in biopsies.Results The high affinity aptamer was screened from the 6th rounds selection,named HP1.The aptamer HP1 was used to distinguish the HP from non-HP and its binding force with HP was detected.Conclusion The high-affinity aptamers binding to HP is successfully selected from the initial ssDNA library,which lays a foundation for the development of HP infection diagnostic reagents.

helicobacter pylori; SELEX; aptamer; diagnosis

广东省深圳市科技计划非资助项目(201203315)。

黄震，男，在职博士，副主任检验师,主要从事临床免疫检验研究。△

,E-mail:nfyywangqian@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.012

A

1672-9455(2015)14-2006-03

2015-02-20

2015-03-20)