吸烟对慢性牙周炎老年患者病情进展和复发的影响

鲁 诚

(南京大学医学院附属口腔医院，南京 210009)



·论 著·

吸烟对慢性牙周炎老年患者病情进展和复发的影响

鲁 诚

(南京大学医学院附属口腔医院，南京 210009)

目的 探究吸烟对慢性牙周炎老年患者病情进展和复发的影响。方法 选取2012年1月至2014年1月南京大学医学院附属口腔医院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸烟者25例作为观察组，不吸烟者25例作为对照组。抽取50例患者前臂静脉血5 mL并离心提取血清，于血清中分别加入吸烟个体和非吸烟个体的血清200、400、800 μL至牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染KB细胞模型，作用12 h后，使用脑心浸液琼脂培养基对细菌进行5～7 d的培养，计数细菌菌落。使用人酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒对2组患者上清液中的基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-9和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的浓度差异进行测定。对2组血清中分别加入不同体积血清对Pg内化KB细胞的影响和KB细胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的差异进行分析。比较2组血清中加入相同血清量Pg内化KB细胞及KB细胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1浓度的差异。结果 加入不同体积的血清后对照组个体血清Pg内化KB细胞的菌落数均明显小于吸烟组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组个体血清加入不同体积血清Pg内化KB细胞的菌落数差异均有统计学意义(P<0.05)。随着吸烟组血清剂量的增加，KB细胞表达MMP-1、MMP-9、TIMP-1的质量浓度增加，不同体积的血清引起MMP-1、MMP-9、TIMP-1表达的差异均有统计学意义(P<0.05)。当加入800 μL吸烟组血清与加入800 μL非吸烟组血清比较，KB细胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的质量浓度均明显升高(P<0.05),差异有统计学意义。结论 吸烟个体的血清能够促进Pg内化KB细胞产生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促进慢性牙周炎的进展和复发。

吸烟； 慢性牙周炎； 基质金属蛋白酶类

慢性牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的感染性疾病，是常见的牙齿支持组织多发疾病[1]。临床主要表现为牙龈组织的炎性水肿出血，同时龈下菌斑和其产物对宿主细胞产生刺激并释放出多种炎性介质，同时与宿主细胞产生免疫反应协同作用促进牙槽骨的吸收[2]。烟草中的尼古丁和可替丁能够促进牙龈卟啉单胞菌(Pg)黏附及侵入KB细胞这一过程，进而引起并促进牙周炎的发展[3]。因此，使用吸烟个体的血清替代龈沟液能够全面地反映烟草在Pg内化牙龈上皮细胞中的作用。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2014年1月南京大学医学院附属口腔医院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸烟者25例，年龄45～75岁，平均(57.3±11.4)岁。不吸烟者25例，年龄为47～78岁，平均(55.3±10.2)岁。纳入标准：(1)经临床诊断为慢性牙周炎患者。(2)3个月内未使用过抗生素、免疫调节剂等。(3)已签署知情书并自愿参加本项研究者。排除标准：(1)不符合上述纳入标准者。(2)合并多种急慢性疾病或免疫系统疾病者。(3)严重精神疾患者者。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 (1)抽取患者前臂静脉血5 mL离心后收集血清，保存于-80 ℃。(2)常温复苏后，接种于新鲜配置的含1%氯化血红蛋白、5%无菌脱纤维羊血、0.1%维生素K1的脑心浸液琼脂培养基，置于37 ℃的厌氧环境中培养5～7 d。(3)革兰氏染色和生化鉴定为Pg ATCC33277纯培养，使用液体培养在4 ℃环境中培养24 h，并使用5 000 r/min的速率离心10 min收集细菌，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次后，重悬在无抗生素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养液中，使用紫外分光光度计测量600 nm处的吸光度值，然后调节菌悬液至1×108CFU/mL作备用。(4)细菌液体在增菌后采取抽签法抽取15个样本，对这些样本进行革兰氏染色后使用PCR法鉴定Pg。

1.2.2 细胞培养 在低糖DMEM中接种常规复苏KB细胞株ATCCCCL17，饱和适度为50 mL/L CO2和37 ℃的环境中培养传代1～2代。在显微镜下可以观察到此时细胞形态为“铺路石”状，在瓶底80%～90%长满时使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的2.5 g/L的胰蛋白酶进行消化，并对细胞的质量进行计数，将细胞密度调整为2×108/L，使用2.5 mL低糖DMEM接种于6孔板上，然后继续培养24 h后确保细胞为贴壁状态。

1.2.3 计数细菌菌落数 贴壁状态的KB细胞长满6孔板的80%～90%时，细胞的数量计数结果为2.5×106个/孔，使用PBS 冲洗3次后，更换低糖DMEM并加入2.5×108CFU/mL Pg，确保感染复数为100∶1，不加入Pg的孔为阴性对照。在观察组和对照组患者的血清中分别加入非吸烟个体和吸烟个体的血清200、400、800 μL至Pg感染KB细胞模型，不加入任何个体血清的孔为阴性对照。共同孵育2 h后每个样本形成3个负孔，使用PBS冲洗3次后以清除未黏附到KB细胞的Pg，加入含有抗生素的DMEM孵育1 h，使用PBS洗涤4次，12 h后充分吸收500 μL上清液，在-80 ℃环境下保存。剩余的DMEM扔掉后，使用PBS冲洗4次，在每个孔中加入1 mL灭菌双蒸水裂解细胞90 min后将悬液等比稀释，取100 μL接种于新鲜配制的含1%氯化血红蛋白、5%无菌脱纤维羊血、0.1%维生素K1的脑心浸液琼脂培养基中培养5～7 d，计数细菌菌落。

1.2.4 检测方法 按照MMP-1、MMP-9、TIMP-1试剂盒说明进行操作，使用酶标仪(瑞士，Infinite M200，Tecan company)对每个孔450 nm处的吸光度值进行测定，使用MasterPlex2010软件将标准曲线绘制出来，并计算相应的吸光度值对应的浓度。

2 结 果

2.1 2组不同体积血清对Pg内化KB细胞菌落数的影响 研究结果显示，加入不同体积的血清后对照组个体血清Pg内化KB细胞的菌落数均明显小于吸烟组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组个体血清加入不同体积血清Pg内化KB细胞的菌落数差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组不同体积血清对Pg内化KB细胞菌落数的影响

注：-表示无数据。

2.2 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生MMP-1的作用 研究结果显示，随着吸烟个体血清体积的增加KB细胞表达MMP-1的质量浓度增加，而非吸烟个体的血清对KB细胞表达MMP-1的影响不大。当加入200 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌MMP-1的质量浓度差异无统计学意义(P>0.05)。当加入400和800 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌MMP-1的质量浓度差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生MMP-1的作用

注：t1为加入Pg的观察组与对照组相比较；t2为不加入Pg的观察组与对照组相比较。与加入Pg的对照组相比,△P<0.05。-表示无数据。

2.3 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生MMP-9的作用 研究结果显示，随着吸烟个体血清体积的增加KB细胞表达MMP-9的质量浓度增加，而非吸烟个体的血清对KB细胞表达MMP-9的影响不大。当加入200和400 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌MMP-9的质量浓度差异无统计学意义(P>0.05)。当加入800 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌MMP-9的质量浓度差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生TIMP-1的作用 研究结果显示，随着吸烟个体血清体积的增加KB细胞表达TIMP-1的质量浓度增加，而非吸烟个体的血清对KB细胞表达TIMP-1的影响不大。当加入200 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌TIMP-1的质量浓度差异无统计学意义(P>0.05)。当加入400和800 μL血清时，2组血清中KB细胞分泌TIMP-1的质量浓度差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生MMP-9的作用

注：t1为加入Pg的观察组与对照组相比较；t2为不加入Pg的观察组与对照组相比较。与加入Pg的对照组相比，△P<0.05。-表示无数据。

表4 2组血清对Pg内化KB细胞过程中产生TIMP-1的作用

注：t1为加入Pg的观察组与对照组相比较；t2为不加入Pg的观察组与对照组相比较。为与加入Pg的对照组相比较，△P<0.05;与不加入Pg的对照组相比，*P<0.05。-表示无数据。

3 讨 论

Pg能够侵入到宿主细胞的上皮细胞中并存活在其中，在一定的条件下Pg能够游移出细胞，促进慢性牙周炎的复发[4]。MMP是一族能够降解细胞外基质的锌离子依赖性蛋白水解酶，MMP-1是一种成纤维细胞型胶原酶，能够降解细胞外基质中最为丰富的胶原，促进微生物感染向深部组织的扩散运动[5]。MMP-9是一种降解基底膜的重要蛋白酶，是由各种基质细胞保持酶原的形式在细胞内合成的，最终分泌到细胞外侧，对骨吸收和骨组织的重建发挥作用[6]。TIMP是一种相对分子质量为2.9×104的糖蛋白，能够调节和抑制已经被激活的MMP-9、MMP-1[7]。因此，在机体内的MMP和TIMP之间的分泌与降解过程中保持着稳定的关系，这种平衡稳定的关系能够维护牙周组织的健康，但是烟草内有害物质的作用会打破MMP和TIMP的平衡状态[8]。本文通过模拟慢性牙周炎患者在吸烟和非吸烟个体血清中的存在条件，Pg内化KB细胞的数量，对2种个体血清对KB细胞分泌的MMP-9、MMP-1、TIMP-1浓度的影响进行了探究，进而探究了吸烟对慢性牙周炎老年患者病情进展和复发的影响。

吸烟者的口腔卫生一般较差，牙面多堆积菌斑，且形成较多的牙石，舌侧龈退缩，由于尼古丁对牙龈血管的收缩产生刺激作用，造成其血流量减少，同时吸烟使牙龈角化变厚，在牙龈下构成特定的牙周病原体，对某些药物对特定牙周致病菌的抑制作用产生影响，因而吸烟者牙龈下对特定致病菌的感染率较高。本文研究结果显示，患有慢性牙周炎的吸烟个体预后较差，复发率较高。这与王宏岩等[9]研究结果相同。这是由于烟草中的尼古丁和可替丁会对包括PgfimA在内的58中基因表达产生影响，而fimA基因对细菌黏附和侵入的过程发挥着重要作用，fimA基因表达上调后能够有利于Pg对KB细胞的侵入[10]。而不同浓度的尼古丁和可替丁还能够调节RagA等相对分子质量的表达，而这些相对分子质量的表达上调会促使细菌产生更多的能量和毒力来维持细菌内化细胞的进程[11]。同时吸烟会降低多形核白细胞(PMN)的吞噬能力和趋化性，减少患者机体的单核细胞数量和淋巴细胞的数量，当炎性反应发生时，PMN和淋巴细胞等就不能有效地杀伤、吞噬和降解组织碎片和病原微生物，导致继发性和原发性的免疫能力低下。而本项研究中，加入不同量的吸烟者个体的血清后，与非吸烟者个体血清相比促进了Pg内化KB细胞的数量，并且随着加入血清量的增多这种差异也越明显。造成这种现象的原因可能为血清中的某些烟草成分通过上调Pg的某些蛋白或基因，上调了Pg侵入细胞的能力和毒力作用，也可能是由于烟草成分加速了上皮细胞的胶原降解而使促进了细菌的侵入，具体原因还需要进一步进行研究。同时烟草能够通过造成局部缺氧环境使MMP和TIMP的表达增高。本文中加入大剂量吸烟个体血清时，KB细胞分泌的MMP-1和MMP-9的浓度也明显升高，TIMP-1的浓度也随之升高，这可能是由于随着MMP-1和MMP-9的分泌增多，KB细胞代偿性的分泌TIMP-1，来保持机体内MMP和TIMP的相对平衡状态，进而保持局部组织的相对稳定和健康的状态[12]。本研究中发现吸烟组患者在进行局部检查时其指标存在较大的个体差异，这进一步说明吸烟是牙周炎的重要危险因素，但牙周炎是一种多因素诱发的疾病，这些因素互相拮抗且互相影响，在不同的环境和宿主中产生较大的影响，因此临床中采用牙周治疗能够改善口腔卫生状况去除致病因素，这种治疗方法对吸烟者和不吸烟者均能够发挥较佳的临床疗效。

综上所述，吸烟个体的血清能够促进Pg内化KB细胞产生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促进慢性牙周炎的进展和复发。也就是说吸烟患者的口腔环境会导致Pg发挥致病作用，进而促进慢性牙周炎进展和复发。

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Influence of smoking on disease progression and relapse in elderly patients with chronic periodontitis

LUCheng

(AffiliatedStomatologicalHospital,MedicalCollegeofNanjingUniversity,Nanjing,Jiangsu210009,China)

Objective To investigate the influence of smoking on disease progression and recurrence in elderly patients with chronic periodontitis.Methods 50 cases of chronic periodontitis patient in our hospital from January 2012 to January 2014 were selected,among them 25 cases of smoking were taken as the observation group and 25 cases of non-smoking as the control group.5mL of forearm blood was collected in 50 patients and centrifuged for extracting serum.The serum 200,400,800 μL in smoking individual and non-smoking individuals were added to porphyromonas gingivalis(Pg) infecting the KB cell model,after 12 h action,the brain heart infusion agar medium was used for conducting 5-7 d bacterial culturing and the bacterial colonies were counted.The human enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit was used to detect the concentration differences of matrix metalloproteinases(MMP)-1,MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1) in the supernatant of two groups.The influence of adding different volumes of serum on the Pg internalizing KB cells and the differences of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were analyzed.In adding the same volume of serum,Pg internalizing KB cells and difference of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were compared between the two groups.Results After adding different volumes of serum,the colonies of Pg internalizing KB cells in control group individual serum were significantly less than those in the smoking group,the difference was statistically significant(P<0.05).In adding different volumes of serum in the two groups individual serum,the difference of colonies number of Pg internalizing KB cells were statistically significant(P<0.05).With increasing doses of serum in the smoking group,KB cells expressed MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were increased,the MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 expression differences caused by different volumes of serum were statistically significance(P<0.05).Comparing adding 800 μL of smoking group serum with 800 μL of non-smoking group serum,KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were significantly increased(P<0.05).Conclusion Smoking individual serum can contribute to Pg internalizing KB cells to produce MMP-1,MMP-9 and TIMP-1,thus promote the progression and recurrence of chronic periodontitis.

smoking; chronic periodontitis; matrix metalloproteinases

鲁诚，男，主治医师，本科，主要从事口腔修复相关方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.026

A

1672-9455(2015)15-2204-04

2015-02-16

2015-04-15)