葡萄糖的测定方法与应用研究进展*

冯 东，李秋顺，刘 凤，李恒杰，李大海，史建国

(1.山东省生物传感器重点实验室 山东省科学院生物研究所，山东 济南250014;2.山东省金乡县鸡黍镇中学，山东 济宁272208;3.济宁市高级职业学校，山东 济宁272100)

0 引 言

葡萄糖是易溶于水、有甜味、在自然界分布极广的一种无色单糖，用途十分广泛。在人体中，葡萄糖能快速补充能量、促进肝脏解毒、加强记忆等。葡萄糖的浓度对生理活动有很大影响。如果浓度过低，可能造成中风或其他的血管疾病;浓度过高会导致肥胖、糖尿病、肾脏病、心脏病及神经损伤等［1～3］。在发酵生产中，葡萄糖是菌体生长和产物合成的主要碳源，其含量直接决定着生产菌增殖、代谢的数量［4］。此外，葡萄糖是食品加工、造酒、制药、制镜、印染制革等生产的重要原料［5］。因此，准确测定葡萄糖含量对于糖尿病等疾病的治疗决策和工业生产产量的控制具有重要意义。

1 葡萄糖的检测方法

目前，已经发展的葡萄糖检测方法很多，其原理有:利用化学性质(还原性)来测定、利用其物理性质来测定、结合特异性相互作用来测定等，实际可根据应用场合来选择适合的测定方法。酶法测定也是葡萄糖测定的常用方法，此类方法易于发展成测定仪器，本文也将专门介绍。

1.1 利用化学性质测定

1.1.1 氧化还原滴定法

氧化还原滴定法是指将待测样品精密加碘滴定液后，边振摇边滴加NaOH 滴定液，在暗处放置30 min，加稀硫酸，用硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时，加淀粉指示液继续滴定至蓝色消失，根据滴定液使用量，计算葡萄糖的含量。该方法在测定右旋糖酐40 葡萄糖注射液中葡萄糖的含量中被普遍采用。

1.1.2 碘—淀粉体系褪色光度法

碘与淀粉体系褪色光度法的原理是利用葡萄糖还原性和碘与淀粉能形成蓝色配合物的性质。待测液中加入适量NaOH 后，I2与NaOH 生成的NaIO 能定量地将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，过量的NaIO 则歧化生成NaIO3和NaI。然后将体系调至酸性，NaIO3与NaI 反应重新生成I2，析出的I2又与淀粉形成蓝色配合物。反应前后的吸光度差与加入的葡萄糖含量呈良好的线性关系，据此可以测定葡萄糖的含量。

梁奇峰等人采用此法测定蜂蜜样品中葡萄糖含量，结果显示，在葡萄糖含量1.00 ～8.00 mg/L 的范围内，反应前后吸光度差与加入的葡萄糖含量有良好的线性关系。测得葡萄糖含量为29.4%，相对标准偏差为0.6%(n=6)，加标回收率为98%～102%(n=6)，检出限为0.0152 mg/L，测定结果与国标高效液相色谱法相近［6］。

1.1.3 葡萄糖己糖激酶法

其原理是己糖激酶催化葡萄糖生成葡糖—6—磷酸。之后葡糖—6—磷酸被氧化，同时产生还原型β—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。系统将监测340 nm 的光吸收变化，该变化与样品中的血糖浓度呈正比，依此计算并给出血糖浓度。

1.2 利用物理性质测定

1.2.1 中红外衰减全反射光谱法

葡萄糖在中红外波段具有1 152，1 108，1 080，1 035，992 cm－1等5 个葡萄糖基频特征吸收峰，因此，中红外衰减全反射(attenuated total reflectance，ATR)光谱方法能够测量葡萄糖浓度。

孙长月等人采用中红外ATR 光谱法，分别采集自然状态和渗透状态时皮下组织中的葡萄糖的光谱数据，应用二维相关光谱技术分析了两种状态下组织液中的葡萄糖浓度。结果表明:利用低频超声和真空负压等物理或化学辅助方法将组织液渗透到皮肤表层，可以实现中红外ATR 光谱法检测皮下组织液中葡萄糖［7］。

余松林等人利用ATR 传感器测量了磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中葡萄糖浓度。结果表明:5 个测量波长下的吸收度与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系(R2＞0.99，SD ＜0.000 4，P ＜0.000 1)，且该波长可调谐激光光谱测量系统的灵敏度是传统傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪的4 倍左右［8］。

1.2.2 高效液相法

高效液相色谱(HPLC)法是检测生化分子的通用方法，葡萄糖液可以用此法测定。葛姗姗等人采用HPLC 法，测定红腺忍冬叶水提液中葡萄糖的含量。12 批次红腺忍冬叶的检测结果表明，该方法能使葡萄糖和其它物质得到良好的分离。线性范围为33.75 ～2 160 mg/L，精度为1.31%，稳定性分别为2.25%，重复性为1.85%，平均加样回收率为97.58%［9］。

杨军等人采用HPLC 法检测基因工程菌发酵液中葡萄糖的含量。其使用Aminex HPX—87H 柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，以5 mmol/LH2SO4溶液作为流动相，在柱温35 ℃、流速0.60 mL/min 的条件下，用示差折光检测器对重组大肠埃希菌和毕赤酵母发酵过程中的葡萄糖含量进行检测。结果表明:在标准曲线线性范围内，葡萄糖浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数在0.999 97 ～0.999 98 之间，平均加样回收率为102.18%;重复6 次检测发酵液，葡萄糖峰面积的RSD 为0.15%［10］。

1.3 利用特异性相互作用

利用特定物质对葡萄糖分子的特异性识别，可以结合表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)等技术进行测定。当金膜表面配位体与分析物发生相互作用，会导致SPR 信号变化，从而进行测定。

黎振华等人通过特异性识别作用在SPR 传感器的金膜表面构建了伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修饰的金纳米颗粒自组装膜。当有葡萄糖存在时，膜被分解，从而实现对葡萄糖的灵敏检测。结果表明，该传感器可以选择性地检测0.1 ～100 mmol/L浓度范围内的葡萄糖溶液，且敏感膜可以多次再生使用［11］。

1.4 酶法测定

1.4.1 葡萄糖氧化酶法

葡萄糖氧化酶法原理如下:葡萄糖被葡萄糖氧化酶(GOD)氧化生成葡萄糖酸和H2O2，H2O2又经辣根过氧化物酶(POD)作用，分解出氧，将无色的4—氨基安替比林和苯酚偶联氧化，并缩合成红色醌亚胺，其颜色深浅与葡萄糖浓度呈正比，在530 nm 下的吸收峰度值会随葡萄糖浓度的增加而增加。利用这一原理可以测定葡萄糖含量［12］。

1.4.2 葡萄糖氧电极法

葡萄糖氧电极法的原理是采用氧消耗速率检测葡萄糖，首先将氧电极置于含有适量葡萄糖氧化酶的溶液中，然后加入待测样品，样品中的葡萄糖被氧化而消耗氧。由于氧消耗量与血糖浓度呈正比，而电极的极限扩散电流又与溶液中的氧含量呈正比，因此，氧电极值即可反映样品中血糖浓度。

闫长领等人采用电化学聚合技术，用掺杂苯磺酸钠的聚吡咯(PPy)导电薄膜修饰铅笔芯电极，在修饰电极表面吸附葡萄糖氧化酶制备了葡萄糖生物传感器。该生物传感器抗干扰能力强、稳定性好，响应电流和葡萄糖浓度在0 ～0.7 mmol/L 范围内有良好的线性相关度(R=0.997 6)，灵敏度为26.10 μA/mmol/L，平均响应时间约为6.5 s，检测下限为47.2 μmol/L［13］。

Zhang Lingling 等人通过恒电位阳极氧化法制备了TiO2纳米管阵列，并通过物理吸附的方式将GOD 固定在纳米管阵列上，开发了一种简单、廉价的检测葡萄糖的电化学生物传感器。该传感器对葡萄糖的响应时间为8 s，线性范围是0.4 ～3.6 mmol/L 检测限为5 μmol/L，灵敏度为56.7 μA/cm2/mmol/L，并且2 mmol/L 果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖均对测试结果无干扰［14］。

1.4.3 纳米材料模拟酶比色法

葡萄糖氧化酶传感器检测葡萄糖浓度，具有专一性高、反应速度快等特点。但酶本身固有的不稳定性，易受温度、湿度以及pH 值等环境条件的影响而失去活性，而且葡萄糖氧化酶价格昂贵、制备复杂，这在一定程度上限制了酶传感器的应用。利用具备催化活性的纳米材料，能够研制无酶葡萄糖传感器。

石文兵等人基于CeO2NPs 催化TMB 显色反应与H2O2浓度的线性关系，构建了测定血样中葡萄糖的模拟酶比色分析检测方法。他们首先合成了一种稳定和水溶性的聚丙烯酸修饰的CeO2NPs，发现CeO2NPs 能够催化H2O2氧化，表现出过氧化物模拟酶的催化活性。在优化条件下，对葡萄糖的线性响应范围为0.5 ～10 mmol/L，检出限为0.1 mmol/L。对1.0 mmol/L 葡萄糖进行11 次平行测定，其相对标准偏差为2.4%。即使果糖、乳糖和麦芽糖的浓度高达5 mmol/L，也不会干扰葡萄糖的测定，具有很高的选择性［15］。

1.4.4 无酶型葡萄糖电化学法

无酶葡萄糖电化学法也是不使用葡萄糖氧化酶的葡萄糖测定方法，具有较高的稳定性、良好的重现性和成本低廉等特点，近年来得到了快速发展。

目前，已经有单一金属(Pt，Pd，Au 等)、双金属(Pt—Au，Pt—Pb，Pt—Ru，Pt—Bi，Pt—Ti 等)及碳纳米管、碳纤维、介孔碳等纳米材料被用于无酶型葡萄糖电化学传感器的研制。

易静等人通过电化学沉积的方法将Pt—Pd 双金属纳米粒子沉积在裂解碳纳米管(UCNTs)修饰的电极表面上，制备了Pt—Pd/UCNTs 无酶葡萄糖传感器。该传感器对0 ～20 mmol/L浓度范围内的葡萄糖有良好的响应，不受Cl－等物质的干扰，表现了良好的选择性［16］。

Sejin Park 等人利用纳米级尺寸的铂介孔结构建立了非酶型葡萄糖电流传感器。该传感器对葡萄糖的灵敏度高达9.6 μA/cm－2/mmol/L，且不受抗坏血酸和对乙酰氨基酚等物质的干扰，对葡萄糖有较好的选择性。即使在高浓度氯离子的存在下，也表现了较好的重复性［17］。

虽然葡萄糖的测定方法很多，但各种方法均有适合应用的场合。氧化还原滴定法等化学方法利用的是葡萄糖的还原性，测定容易进行，但其它单糖和其它还原性物质均会干扰测定结果;中红外穿透深度有限，采用中红外ATR 光谱法获得深层液体中的葡萄糖信息是尚需解决的技术难题;高效液相色谱法结果准确，但进行复杂样品测定时要反复摸索分离条件，不利于快速测定;SPR 法检测灵敏度高，但需要精心设计与葡萄糖特异性作用的分子并修饰到金膜表面，对设备的要求也很高;酶法测定特异性好，不易受其它物质干扰，但酶的成本高，对应用领域也有限制。因此，没有一种测定方法能够使用所有场合，需要根据情况加以选用。

2 葡萄糖检测仪器在实际生产中的应用

1)血糖仪

血糖仪按照工作原理分为葡萄糖氧化酶光化学比色法和电极法两大类。光化学比色法血糖仪主要有国内市场强生稳步ONE Touch Sure Step、罗氏ACCU－CHEK Active(活力型)。电极法便携式血糖仪是测定血液中葡萄糖含量的一种简便携带的仪器，其原理是葡萄糖与含有葡糖糖酶和氰铁化物的试纸接触后产生一个小电流，电流通过血糖仪测定，并显示相应数值。它具有灵敏度高、检验周转期短、容易使用、用血量极少、操作简便以及分析速度快等优点，是目前临床测定血糖水平的常用手段，已被广泛应用于临床各科室中。以电极法为代表的几款即时检验血糖仪(POCT)如德国拜耳的拜安康TM、拜安捷2、美国雅培公司的Optium Xceed、强生公司的LIFE SCAN 均已在临床中发挥作用。

2)全自动葡萄糖生物传感分析仪

在国内，山东省科学院生物研究所史建国、冯东等人以葡萄糖氧化酶—电极法原理为基础，研制的SBA 系列葡萄糖生物传感分析仪［18］在国内处于比较领先的地位，该种传感器具有对不受待测液中其他成分的干扰、仪器重现性和稳定性较好、成本低、检测精度高、检测速度快等优点，突破了仅仅处在实验室试验研究阶段的瓶颈，已经在发酵工业、冷却肉糖原、酱油成分分析、医学检验等实际生产领域被广泛应用。

在国外，美国YSI 公司的YSI2300 STAT PLUS 葡萄糖乳酸分析仪、德国EKF 公司的BIOSEN C—Line 葡萄糖/乳酸分析仪、瑞典Chemel AB 公司的SIRE 系列葡萄糖分析仪均已被广泛地用于食品、发酵工业葡萄糖的离线测量。

3 结束语

以酶为基础的葡萄糖传感器研究相对成熟，已经走出实验室研究阶段，在生产中得到了较为广泛的应用。然而，酶的活性容易随环境的变化而逐渐减低甚至丧失，造成了酶葡萄糖传感器局限于高昂的成本和较低的使用寿命。21 世纪以来，具有新性能的各种纳米材料不断涌现，为新型葡萄糖传感器的研发提供新的机遇，虽然非酶葡萄糖传感器的研究现在还只是停留在实验室阶段，但随着研究方法的不断更新和新技术工艺的不断完善，有望在将来研制出灵敏度高、稳定性好、选择性好、费用低、拥有较长寿命的、可以在工业生产中使用的非酶葡萄糖传感器。传统方法与荧光淬灭、拉曼光谱等方法的联合应用也有望在新型葡萄糖的传感器研制方面取得进展，解决发酵过程中需要取样、无法在原始发酵液实时检测的难题。同时，与电脑、手机等智能系统网络的结合也有望在葡萄糖的连续、在线、实时的检测方面以及糖尿病远程检测诊疗等方面取得新成就。

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