新质粒介导喹诺酮耐药基因qnrB24的基因分析*

邵宜波，李 旭，谢琴秀，胡立芬，顾有为

(安徽医科大学第一附属医院:1.感染管理科；2.感染科；3.中心实验室，合肥 230022)



·论 著·

新质粒介导喹诺酮耐药基因qnrB24的基因分析*

邵宜波1，李 旭2△，谢琴秀2，胡立芬3，顾有为1

(安徽医科大学第一附属医院:1.感染管理科；2.感染科；3.中心实验室，合肥 230022)

目的 对新的质粒介导喹诺酮耐药基因(qnrB24)进行相关研究和分析。方法 对新发现的qnrB24基因阳性菌株进行转移接合实验，了解qnrB24对喹诺酮类药物的耐药性，碱裂解法提取接合子质粒，Southern blot明确质粒大小。采用热不对称交错聚合酶链反应(PCR)技术研究基因5′端以及3′端未知侧翼碱基序列。结果 这个突变基因命名为qnrB24(Genbank登录号HM192542)。药敏试验结果显示携带qnrB24基因接合子对环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC)值为0.125 μg/mL，左氧氟沙星MIC值为0.190 μg/mL。接合子对常见氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性较大肠杆菌J53受体菌下降约8～11倍，接合子耐药水平低于临床分离菌株。Southern杂交显示该基因位于约60.0 Kb质粒上。热不对称交错PCR结果显示,qnrB24基因5′端为假定的转座酶。结论 qnrB24通过质粒介导引起细菌对喹诺酮类药物的耐药性上升，容易发展成高水平耐药，因此需要监测其在细菌中的流行性。

质粒介导喹诺酮类耐药基因； 氟喹诺酮耐药； qnrB24； 功能分析

质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)近几年已成为研究的热点。最初发现qnr是一种质粒介导的水平传播的喹诺酮类耐药基因，其编码蛋白可以解除喹诺酮类药物对DNA旋转酶的毒性[1]。随后全球已报道包括qnrA、qnrB，qnrC、qnrD在内的多种qnr基因。该类基因的表达不仅可引起喹诺酮类药物的低水平耐药，而且可明显增加其他耐药机制的作用。因其位于质粒上，耐药基因可以通过质粒在不同菌株、甚至不同菌属间水平传播，容易引起耐药菌株在医院内的传播流行；而且这些基因可以通过质粒接合、转座等途径和位于质粒上的其他耐药基因一起迅速传播[2-3]，使得菌株呈现多重耐药，给临床用药带来巨大威胁，从而导致临床治疗困难、医院内感染增加。本文对临床上分离的1株弗劳地枸橼酸杆菌中发现的质粒介导喹诺酮类耐药基因新亚型qnrB24(该基因已经在GENBANK注册，注册号HM192542)做了Southern杂交、转移接合、并用热不对称聚合酶链反应(PCR)方法研究该基因的旁侧序列。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 1株本院临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌(编号09-906546)于2009年7月7日分离自本院普通外科4病区1例66岁男性患者的中段尿标本。

1.2 qnrB 引物：共用2 对qnrB引物,引物序列见表1。

1.3 抗菌药物E-Test纸条 瑞典AB BIOMERIEUX公司提供左氧氟沙星，环丙沙星E-Test纸条。

1.4 试剂 大连宝生物公司提供Taq酶、dNTP、10×buffer,DNA marker,上海生物工程有限公司合成PCR引物，MH琼脂购自英国Oxoid公司，德国QIAGEN质粒提取用试剂盒，武汉博士德有限公司提供杂交试剂盒，大连宝生物公司提供热不对称交错PCR试剂盒。

表1 qnrB24引物序列和PCR反应参数

1.5 方法

1.5.1 转移接合试验 按照文献[4]的方法对临床分离产qnrB24基因型菌株进行转移接合实验。大肠杆菌(E.coli)J53为接合实验的受体菌。选择性平板为含氨苄西林(64 μg/mL)和叠氮钠(100 μg/mL)的MH琼脂平板,在MH平板上生长的白色小菌落即为接合子,并传代3次。对接合子进行生化鉴定和PCR。

1.5.2 药敏试验方法 用E-Test纸条判断临床菌株,接合子及受体菌对喹诺酮类药物敏感性，采用2010年美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准判断药敏结果。

1.5.3 质粒抽提 qnrB24基因型接合子质粒的提取按照QIAGEN质粒提取试剂盒说明书操作步骤进行。

1.5.4 Southern杂交操作程序 按武汉博士德有限公司杂交试剂盒说明书进行操作。

1.5.5 热不对称交错PCR 按大连宝生物公司热不对称交错PCR试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1 qnrB24基因的检测 qnrB24基因PCR阳性结果见图1。qnrB24基因与qnrB10同源性为98.67%，与qnrB1同源性是96.92%。与qnrB10相比，共6个碱基位点发生变化，42位T→A,139位C→A，257位C→T，643位C→T，670位A→G，672位T→G。其中139位、257位、670位碱基位点改变导致了氨基酸发生变化，氨基酸的改变分别为47位亮氨酸→蛋氨酸，86位丙氨酸→缬氨酸，224位异亮氨酸→缬氨酸。qnrB24与qnrB10、qnrB1氨基酸同源性见表2。

注：M为DL2000；1为qnrB通用引物扩增结果；2为qnrB24全CDS引物扩增结果。

图1 PCR 扩增qnrB24基因结果表2 qnrB24与qnrB10、qnrB1氨基酸的同源性

2.2 临床菌株、受体菌接合子的最小抑菌浓度(MIC)值 携带qnrB24基因接合子对左氧氟沙星、环丙沙星敏感性均有下降，均较E.coliJ53受体菌下降大约8倍,临床分离菌株耐药水平高于接合子，见表3。

表3 临床菌株、受体菌和转移接合株对常见喹诺酮 类抗菌药物的MIC值 (μg/mL)

2.3 Southern 杂交结果 Southern Blotting 分析再次证实qnrB24的基因位于质粒上,并定位于60.0 Kb 的质粒，见图2。

注：A 接合子质粒电泳图，B对应的Southern杂交图(qnrB探针)。

图2 Southern杂交结果

注：M1为λ-Hind Ⅲ digest；1～3为AP1 1st 2nd 3rd PCR产物；4～6为AP2 1st 2nd 3rd PCR产物；7～9为AP3 1st 2nd 3rd PCR产物；10～12为AP4 1st 2nd 3rd PCR产物；13～15为正对照 1st 2nd 3rd PCR产物；M2为DL2000。

图3 qnrB24基因5′端未知侧翼序列1、2、3次的PCR 产物电泳图

2.4 热不对称交错PCR旁侧测序结果 通过 PCR 扩增后发现编号09-906546的弗劳地枸橼酸杆菌不携带有Ⅰ类整合子基因盒插入序列。并通过对编码qnrB24基因上下游分析发现，在目的基因的上下游不存在典型的整合子结构。qnrB24基因的5′端未知侧翼序列PCR产物克隆测序碱基序列在Genbank比对后发现，和5′端相连的核苷酸序列是一个假定的转座酶，3′ 端旁侧未扩增出特异性结果。该突变株5′端热不对称PCR电泳结果见图3。

3 讨 论

自从qnrA被Martinez-Martinez等[1]首次发现后，qnrB、qnrS、qnrC、qnrD等越来越多的PMQR基因陆续被发现[5-6]。研究已经证明qnr及其同源基因广泛存在革兰阴性细菌中[7-8]。研究表明该类基因编码的蛋白能够逆转喹诺酮类对DNA旋转酶的抑制作用，从而引起细菌对喹诺酮类药物的低水平耐药[9]。同时，qnr的存在还能促进染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因耐药决定突变区(QRDRs)的变异，导致高水平耐药[10]。同时发现含有qnr的质粒与β-内酰胺类，复方磺胺甲噁唑，氨基糖苷类等抗菌药物的耐药性有关[2-3,11]。最早发现的qnrB1，它的质粒命名为PMG298，在PMG298中orf1005的下游发现了tnpA等转座基因，在qnrB2的下游发现了Orf1的短片段。Corkill发现qnrB位于携带有其他耐药基因的Ⅰ类整合子上[12]。整合子是一个DNA元件，具有可移动性，它可以通过位点特异性重组从而捕获和整合很多耐药基因，因此可将qnr及其他耐药基因在不同的细菌间传播。细菌的多重耐药往往是qnr与其他多种耐药基因共同整合在一起而引起的，同时包含qnr的菌株更容易发生染色体基因的自发突变从而产生高水平的耐药菌株[13-14]。目前qnr阳性菌株的多重耐药现状严重，可能与qnr阳性质粒或整合子结构上常包含多种耐药基因，同时产超广谱-β内酰胺酶(产ESBLs)或AmpC型β-内酰胺酶[15]。因此，由于PMQR机制的存在，治疗细菌感染时临床医生选择抗菌药物的范围也有所缩小。一旦PMQR在菌株中流行，则对于临床选药更是巨大的挑战。

本研究首次发现了qnrB新的突变体，测定全基因组序列后命名为qnrB24(GENBANK注册号HM192542)，并已被http://www.lahey.org/qnrStudies网站收录。在qnrB亚型中，qnrB24与qnrB10的同源性最高，达98.67%(仅相差3个氨基酸序列)；与qnrB1同源性是96.92%(相差7个氨基酸序列)。接合子的耐药性明显高于受体菌耐药性，说明qnrB24基因可以提高细菌对喹诺酮类药物的耐药性，但对喹诺酮类抗菌药物靶位点的结合作用较低，因此接合子对喹诺酮类药物的耐药性即使有所升高，但没达到临床耐药折点水平，说明可能有其他因素共同作用提高细菌耐药性。通过接合试验及Southern杂交也证实了qnrB24可以通过质粒在不同的菌株之间传播。热不对称PCR结果显示qnrB24的5′端旁侧是一个假定的转座酶，因此需要注意其在医院流行传播的可能。虽然qnrB24的流行率相对较低，但容易发展成高水平耐药，下一步需要进一步监测其流行性，同时对其进行全基因序列测序，了解有无与其他耐药基因共同传播。

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Analysis of plasmid mediated quinolone resistance gene qnrB24*

SHAOYi-bo1,LIXu2△,XIEQin-xiu2,HULi-fen3，GUYou-wei1

(1.DepartmentofNosocomialContrel,2.DepartmentofInfectiousDisease,3.DepartmentofCentralLaboratory,FirstAffliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

Objective To detect and analyze the function of plasmid mediated quinolone resistance gene qnrB24.Methods The positive strains of qnrB24 gene detection were conducted transfer joint experiment,to explore the drug resistant of these strains to quinolonne drug,zygote plasmid was extracted by alkaline lysis method,and the size was detected by southern blot.The unknown base sequence on the wing of gene 5′ end and 3′ end were detected by thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (PCR) technology.Results Susceptibility results showed that the minimum inhibitory concentration(MIC) of the transconjugant (carrying qnrB24 gene) against ciprofloxacin,levofloxacin were 0.125,0.190 μg/mL respectively.The sensitivity of the transconjugant was lower than the recipient starin,but the drug resistance was lower than the bacterial isolated in clinic.Southern hybridization of plasmid DNA from transconjugant of qnrB24 revealed that the gene was located on about 60 Kb plasmid.The quinolone resistance of qnrB24 could be transferred by conjugation.There was putative transposase adjust to 5′flank of qnrB24 gene.Conclusion The qnrB24 gene is discovered firstly.Gene qnrB24 could improve the drug resistance to fluoroquinolones,it′s necessary to monitor the epidemic characteristic of qnrB24 gene.

plasmid mediated quinolone resistance gene; quinolonne drug; qnrB24

2013年度中华医院感染控制研究基金(ZHYY2013-013)；安徽医科大学第一附属医院2012年度国家自然科学基金青年基金院内培育计划(2012KJ09)。

邵宜波，女，博士，主治医师，主要从事感染控制相关研究工作。△

,E-mail：aylixu@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.005

A

1672-9455(2015)04-0444-03

2014-07-07

2014-09-16)