WalkAway 40误鉴定布鲁菌1例

徐鸣皋,丁进亚,徐 娟，孙 洁

(广州军区武汉总医院检验科，武汉 430070)



WalkAway 40误鉴定布鲁菌1例

徐鸣皋,丁进亚,徐 娟，孙 洁

(广州军区武汉总医院检验科，武汉 430070)

布鲁菌； 16S rRNA； 误鉴定

布鲁菌被列为B类生物恐怖战剂，同时也是导致实验室获得性感染的重要病原菌。因此实验室能够准确、快速、安全的鉴定这种病原菌就显得至关重要。从患者血液、骨髓、其他体液及排泄物等任一培养物中分离出布鲁菌即可确诊为布鲁菌病。目前临床实验室广泛使用的全自动血液培养系统如BACTEC和BacT/ALERT已经显著提高了从标本中分离出布鲁菌的速率[1-2]。但是在使用自动化的细菌鉴定系统的过程中，布鲁菌的误鉴定一直都存在。本院从1例不明原因发热患者血液和骨髓中分离出1株缓慢生长细菌，由WalkAway 40鉴定为动物溃疡威克斯菌、莫拉菌属等，而Vitek2 Compact和16S rRNA 基因序列检测鉴定为布鲁菌。

1 临床资料

1.1 一般资料 患者,男性，17岁。入院20 d前于体能训练后出现咽痛，继而出现畏寒、发热，体温最高达40.1 ℃。患者发热时感头痛，咽痛，热退后无特殊不适感，无大汗淋漓，无全身关节疼痛。曾在单位卫生队给予退热处理，体温下降后又复升，且咽痛程度加重，吞咽时尤甚，遂来本院就诊。本院门诊查血常规、肺部X线片正常，双侧扁桃体Ⅱ度肿大，可见白色豆渣样分泌物，以“急性扁桃体炎”收入感染内科。入院时患者否认近期禽类接触史，否认密切接触人群有类似症状。入科后查白细胞介素-6 26.0 pg/mL；抗“O”315.00 U/mL↑、C反应蛋白12.40 mg/L↑，考虑“化脓性扁桃体炎”可能性较大。依次使用过哌拉西林钠舒巴坦钠、克林霉素、左旋氧氟沙星等，因患者持续高热不退一度将抗菌药物调整为替考拉宁。患者入科后即行血液培养和骨髓培养，血液与骨髓经BacT/Alert 3D240培养48 h报阳性，转种血琼脂平板，经2 d培养形成针尖样细小菌落，革兰染色呈红色短小杆菌，氧化酶阳性，动力阴性。取血琼脂平板上菌落分别使用WalkAway 40和Vitek2 Compact鉴定。WalkAway 40 NC31鉴定药敏复合板将血液中分离株鉴定为动物溃疡威克斯菌(74.18%)、洛菲不动杆菌(23.37%)；将骨髓分离株鉴定为莫拉菌属(40.14%)、动物溃疡威克斯菌(21.86%)等。而Vitek2 Compact GN鉴定卡将血液和骨髓中分离株均鉴定为马耳他布鲁菌(99%、98%)。因两种细菌鉴定系统结果不一致，将菌株送至军事科学院复检。因患者入院时正值重点防控禽流感时期，接触史中仅明确无禽类接触史，立刻询问患者是否有牛羊接触史，患者否认。患者在使用替考拉宁后体温逐渐降低，目前体温正常。临床因报告疑似布鲁菌，将抗菌药物更改为米诺环素+利福平，但更改抗菌药物后患者体温持续升高，最高达40.4 ℃。后军事医学科学院回报经16S rRNA基因检测确证为布鲁菌。同时患者回忆起曾于1个月前清扫羊圈，误将羊粪吸入口鼻，1周后出现发热症状。在接触史和病原学检测结果明确后确诊为布鲁菌病，抗菌药物更改为利福平胶囊+多西环素+复方磺胺甲噁唑片，3 d后患者体温峰值出现下降趋势，最高体温降至37.8 ℃，5 d后体温完全正常，未再反复。在患者确诊为布鲁菌病后，患者单位追查羊只去向，查得部分羊只已死亡，并被掩埋，剩余羊只均未检出布鲁菌，也未有新的病例发生。

1.2 标本来源 2013年广州军区武汉总医院一名发热患者的血液和骨髓。

1.3 仪器及试剂 BACT/ALERT 3D240血培养仪，质控菌株：铜绿假单胞菌(ATCC 27853)；西门子Walkaway 40(软件版本V3.0)，NC31鉴定药敏复合板(批号20120922)，质控菌株：大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)；梅里埃Vitek2 Compact(软件版本5.04),GN鉴定卡 (批号241254040)，质控菌株：嗜麦芽窄食单胞菌(ATCC 17666)。

1.4 菌株分离培养 取阳性培养瓶中培养液三区划线接种于血琼脂平板，分别置于35 ℃孵箱和5%CO2孵箱孵育，每日观察平板生长状况及菌落形态。

1.5 16S rRNA基因检测 送至军事医学科学院进行基因测序。

2 讨 论

布鲁菌被误鉴定为动物溃疡威克斯菌或其他细菌是非常危险的。(1)误鉴定会导致实验室工作人员无法采取正确的防护措施。世界卫生组织将布鲁菌列为危险度3级的病原微生物，最低防护要求至少在BSL-2实验室中使用Ⅱ级生物安全柜进行相关操作。而WalkAway 40的鉴定药敏复合板为开放型，检测孔均裸露在外且必须使用手工加样、上板、下板。其上板、下板等操作无法在生物安全柜中完成，在病原菌不明的情况下大大增加了工作人员被感染的概率。相对而言，Vitek2 Compact使用的鉴定卡完全密封，并且采用全自动封闭真空加注系统，自动进行鉴定卡的进样、封口、上卡、退卡，安全性明显高于WalkAway 40。(2)该患者入院初期相关接触史不明确，起病过程不典型，呈持续发热表现，而非典型的波浪热，也未有关节疼痛等相关症状，从而增加了临床诊断的难度，如果误鉴定为动物溃疡威克斯菌或莫拉菌属等，则错误的诊断和病情的延误将难以避免，这会使患者经历错误的抗菌药物治疗，失去早期治疗的最佳时机而发展为慢性全身性感染[3]。(3)如不能及时处理患有布鲁菌病的羊只，流入市场或将布鲁菌传染给其他羊只或密切接触人群，导致布鲁菌病爆发。

自动化细菌鉴定系统对布鲁菌的误鉴定已有相关报道，分析原因可能有如下几点:布鲁菌的生化反应不活泼,鉴定系统缺乏布鲁菌的相关数据库，缺少对应的鉴定卡，加样读数等因素导致某些生化反应速度产生差异等。虽然Vitek2 Compact鉴定布鲁菌的文献报道很多，但亦有误鉴定的报道。杨婧等[4]报道2011～2012年有3株布鲁菌在首次鉴定中被误鉴定为支气管败血鲍特菌(1株)和人苍白杆菌(2株)，而在第2次鉴定中均鉴定为布鲁菌。基于生化方法的不确定性，越来越多的实验室使用分子生物学方法来鉴定布鲁菌。目前，通过16S rRNA 的聚合酶链反应扩增及其产物测序，可以进行快速诊断，能够区分不同种源的布鲁菌，可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查，具有良好的特异性、灵敏度和稳定性[5-6]。

布鲁菌病的发生、发展和转归比较复杂，其临床表现往往不典型，很难以一种症状来确诊，易引起漏诊、误诊[7]。对布鲁菌病的诊断需结合接触史、临床表现和病原学检查来做出综合判断。特别是在非布鲁菌病流行区，在缺乏明显的流行病学接触史，没有典型的临床表现时，病原学检查就显得尤为重要。实验室工作人员应加强和临床医生的沟通，对和动物有密切接触史的患者应高度重视布鲁菌的检出。如果该病因延误治疗而进入慢性期，会对患者造成不可逆转的损害，甚至可能造成终身残疾。基于自动化细菌鉴定系统易出现误鉴定的情况，使用这类系统检出动物溃疡威克斯菌、支气管败血鲍特菌、人苍白杆菌等罕见细菌时，应该使用分子生物学方法进行确证，降低布鲁菌被误鉴定成其他细菌的可能性。

[1]Yagupsky P,Peled N,Press J,et al.Rapid detection of Brucella melitensis from blood cultures by a commercial system[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1997,16(8):605-607.

[2]杨铭，汪定成，邵海连，等．全自动血培养仪中布鲁菌阳性报警时间及与其他病原菌的比较[J]．中国感染控制杂志，2013，12(6)：451-453．

[3]刘俊贤，韩国毅，梁占魁．492例布氏菌病患者临床特点分析[J]．中国地方病防治杂志，2007，22(4)：306-307．

[4]杨婧，任晓庆，褚美玲，等．细菌自动鉴定仪3例布鲁氏菌误鉴定及文献复习[J]．国际检验医学杂志，2012，33(20)：2491-2494．

[5]王汉军，白华民，郝金奇，等．人血布鲁菌的分离培养及PCR鉴定[J]．包头医学院学报，2012，28(6)：22-23．

[6]姜凤华，于刚．布鲁氏菌PCR快速检测方法的建立[J]．现代畜牧兽医，2008(2)：4-5．

[7]宋青松．布鲁氏菌病误诊29例分析[J]．中国误诊学杂志，2008，8(9)：2113-2114．

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.065

B

1672-9455(2015)04-0575-02

2014-05-11

2014-09-18)