耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因的实时荧光定量PCR方法学评价*

欧红玲，陈凤华，王 岩，张巧云，王欣茹

(第二炮兵总医院检验科，北京 100088)



·论 著·

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因的实时荧光定量PCR方法学评价*

欧红玲，陈凤华，王 岩，张巧云，王欣茹△

(第二炮兵总医院检验科，北京 100088)

目的 评估实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测临床标本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)MecA耐药基因的价值。方法 选择该院2013年6～12月125份临床标本，包括血液40份，痰液52份，创面分泌物33份进行FQ-PCR检测和细菌鉴定，分析结果符合率，以检测FQ-PCR的灵敏度及特异性。结果 FQ-PCR的灵敏度为0.159 pg/μL，检测经细菌培养鉴定的菌株，特异性达到100%，与临床标本结果符合率为97.6%。结论 FQ-PCR检测MRSA的MecA基因更加方便、快速，且灵敏度和特异性等性能指标均比较理想，与细菌鉴定结果符合率较高，适合临床广泛应用。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌； MecA基因； 实时荧光定量聚合酶链反应； 微生物鉴定

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的流行是一个严重的临床医学及公共卫生问题。自1961年首次发现MRSA以来[1]，MRSA分离率逐年增高，已成为医院感染重要的革兰阳性细菌。MecA基因在MRSA耐药中起决定性作用，MecA基因与MRSA有很强的相关性，是判断MRSA的“金标准”。美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐用于MRSA耐药的检测方法有纸片扩散法和琼脂筛选法、肉汤和琼脂稀释法。这些检测方法耗时长，均需要在33～35 ℃条件下孵育24 h[2-5]。本文旨在对实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测MecA基因进行方法学评价，并评价其与微生物鉴定的复合率，为临床更好地应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集本院2013年6～12月临床标本125份，其中痰液52份,血液40份，创面分泌物33份。痰液标本均为晨痰，咳痰前先用清水反复漱口，用力咳出呼吸道深部痰液，直接吐入无菌痰盒。共分离菌株39株，其中MRSA 21株，非MRSA 18株(包括其他葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属以及革兰阴性菌等)。

1.2 细菌复苏 将-80 ℃低温保存的菌种置于室温下解冻，按无菌操作原则将菌种转入无菌肉汤中复苏增菌，放置于37 ℃孵育箱18～24 h后转种到血平皿37 ℃孵育18～24 h，长出单个菌落备用。

1.3 细菌鉴定和药敏分析 用Vitek Compact全自动微生物鉴定仪进行细菌鉴定。用头孢西丁纸片扩散法检测MRSA菌株，实验操作和判断标准均参照2013年CLSI文件标准[5]。将金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水配制成0.5麦氏浊度单位的菌悬液，无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于M-H琼脂表面，将每片30 g头孢西丁纸片贴于其上，36 ℃温育16～18 h后测量抑菌环直径。结果判断：抑菌环直径小于或等于21 mm为耐药。

1.4 主要仪器和试剂 FQ-PCR仪(SLAN-96P)，高速离心机(Thermo Pico17)，干式恒温仪(GL-1800,海门其林贝尔仪器制造公司)，MRSA耐药基因检测试剂盒(FQ-PCR法，上海之江生物科技有限公司)，TIANamp Bacteria DNA Kit 细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。

1.5 FQ-PCR扩增

1.5.1 模板的制备 临床标本模版DNA的制备。(1)痰液。取痰液加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30 min液化，取0.5 mL样品至1.5 mL离心管中，再加入0.5 mL 4%NaOH室温放置10 min后13 000 r/min离心5 min。沉淀加无菌生理盐水1 mL打匀，13 000 r/min离心5 min；再重复洗涤1次。弃上清液，沉淀中直接加入50 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min(误差不超过1 min)。13 000 r/min离心5 min，取上清4 μL做PCR。(2)血液。取2 mL抗凝血，静置待自然分层，吸取上层(血浆层)及中层(Buffy coat层)，13 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀中直接加入100 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min。13 000 r/min离心5 min，取上清4 μL做PCR。(3)创面分泌物。标本中加入无菌生理盐水1 mL，13 000 r/min离心2 min，弃上清液，沉淀中直接加入100 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min。13 000 r/min离心5 min，取上清液4 μL做PCR。临床菌株模版DNA的制备，按TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit 细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取细菌DNA，对于较难破壁的革兰阳性菌，加入溶菌酶进行破壁后，再按说明书进行DNA提取。

1.5.2 PCR扩增 (1)FQ-PCR：按照MRSA耐药基因检测试剂盒说明书配成40 μL反应体系：金黄色葡萄球菌核酸FQ-PCR检测混合液35.6 μL,酶(Taq+UNG)0.4 μL,模板4 μL。参数设置：37 ℃变性2 min;94 ℃ 2 min;循环1次，再按93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次；单点荧光检测在60 ℃，反应体系40 μL。该试剂盒可同时检测标本中Nuc基因和MecA基因。其中Nuc基因为金黄色葡萄球菌的特异性基因。(2)普通PCR法：反应体系25 μL，参数设置：94 ℃ 3 min;再按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环40次；72 ℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1.5.3 MRSA FQ-PCR实验结果判断 见表1。

表1 MRSA FQ-PCR不同实验结果判断

注：+表示阳性，-表示阴性。

1.5.4 结果判断 对125份临床标本同时进行FQ-PCR、普通PCR检测和微生物鉴定，统计3种方法的符合率。

2 结 果

2.1 灵敏度 将Vitek Compact全自动微生物鉴定仪鉴定的MRSA临床菌株，进行细菌DNA提取，模版DNA用去离子水10倍比例稀释成15.9 ng/μL、1.59 ng/μL、159 pg/μL、15.9 pg/μL、1.59 pg/μL、0.159 pg/μL、0.015 9 pg/μL系列浓度。结果表明，FQ-PCR的灵敏度为0.159 pg/μL，普通PCR的灵敏度为15.9 pg/μL，FQ-PCR比普通PCR灵敏度高100倍(图1和图2)。

2.2 特异性 21株Vitek Compact全自动微生物鉴定仪鉴定的MRSA菌株经FQ-PCR检测均为阳性，18株经鉴定的非MRSA菌株经FQ-PCR检测为阴性，其中嗜麦芽假单胞菌和表皮葡萄球菌检测到MecA基因，但Nuc基因均为阴性，所以均判定为阴性。结果表明，FQ-PCR检测MRSA特异性为100%。见表2。

1为15.9 ng/μL；2为1.59 ng/μL；3为159 pg/μL；4为15.9 pg/μL；5为1.59 pg/μL；6为0.159 pg/μL；7为0.015 9 pg/μL。

图1 普通PCR MecA基因检测结果

1为15.9 ng/μL；2为1.59 ng/μL；3为159 pg/μL；4为15.9 pg/μL；5为1.59 pg/μL；6为0.159 pg/μL；7为0.015 9 pg/μL。

图2 FQ-PCR MecA基因检测结果表2 39株细菌的MecA基因FQ-PCR检测结果

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.3 重复性 对提取的15.9 ng/μL和1.59 pg/μL高低两种浓度的MRSA菌株DNA模板进行重复性扩增实验，测定结果进行分析。15.9 ng/μL和1.59 pg/μL平均循环阈值(Ct)和变异系数(CV)分别为14.65和29.20、1.39%和2.97%，CV均小于5.00%，显示具有良好的重复性。

2.4 临床标本结果分析

2.4.1 40份血液标本经FQ-PCR和微生物鉴定，其中2份为MRSA；1份MecA基因阳性，Nuc基因阴性，结果判断为MecA基因携带者。与微生物鉴定符合率100%。

2.4.2 52份痰液经FQ-PCR、普通PCR和细菌鉴定，检出阳性标本结果相符的共36份，阴性结果相符的14份；其中2份FQ-PCR和普通PCR检出MecA基因及Nuc基因阴性，而微生物鉴定均为阳性；1份FQ-PCR MRSA阳性，而普通PCR和微生物鉴定为阴性，与微生物鉴定符合率94%。

2.4.3 33份创面分泌物，检出阳性标本结果相符的共4份，阴性结果相符的29份。与微生物鉴定符合率100%。

3 讨 论

MRSA是引起医院相关性和社区相关性感染的重要致病菌之一，自发现以来，其分离率不断上升，已成为医院相关性感染最重要的革兰阳性菌。近年来世界各地不断报道危及生命的社区获得性MRSA感染，防治形势极为严峻。MRSA对抗菌药物的耐药性日趋严重，且对多种抗菌药物耐药，因此MRSA 引起的医院感染一旦发生，常难以控制。随着MRSA分离率的不断上升，快速、准确、及时检测MRSA对临床选用合适的抗菌药物及控制MRSA传播均具有重要意义[6]。MecA基因在MRSA耐药中起决定性作用，它编码的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)与β内酰胺类抗菌药物的亲和力极低，使抗菌药物不能阻碍细胞壁肽聚糖层合成，从而产生耐药性[7]。因此，MecA基因已作为MRSA的分子学标志[8]。

目前，MRSA的检测临床最常用的是纸片扩散法、琼脂筛选法、肉汤和琼脂稀释法。这些检测方法耗时长，均需要在33～35 ℃条件下孵育24 h，易受孵育温度、时间、培养基质量、菌液数量等多种因素的影响[9]。而PCR方法直接检测细菌染色体上的MecA基因，不受药敏实验条件的影响，特异性高，从核酸提取到荧光检测仅需3～4 h，为临床医生的快速诊治提供了更为有效的手段。本研究FQ-PCR的最低检测下限为0.159 pg/μL，灵敏度较普通PCR(15.9 pg/μL)高100倍，特异性达到100%，并对高低两个浓度重复检测的CV均小于5.00%，显示具有良好的重复性，检测性能满足临床检测的需要。

本实验采用FQ-PCR检测2份耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌，结果显示：Nuc基因阴性、MecA基因阳性。与Nuc基因是金黄色葡萄球菌特有基因、MecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌分子学标志的结论一致。本实验采用临床标本直接进行FQ-PCR法检测。2份临床标本FQ-PCR法和普通PCR检测MecA基因阴性，Nuc基因为阴性的痰液，而微生物鉴定为MRSA阳性。分析其原因可能为：(1)使用 4%NaOH液化标本后，未充分洗涤干净，pH过高可抑制PCR，造成假阴性结果；(2)在标本洗涤、冻存、提取 DNA模板过程中，原始标本中的 MRSA菌水平极低，不能有效提取到 MRSA的DNA模板，造成FQ-PCR结果的假阴性。1份痰液标本FQ-PCR检测MecA基因阳性，Nuc基因为阳性，而微生物鉴定为阴性。分析其原因可能为：痰培养受培养基的成分、细菌接种量、培养时间和培养温度的影响，以及受抗菌药物的抑制，而痰液中细菌分布不均一及培养室仅用标本的极少部分，都可能影响微生物培养法MRSA的检出率。另外，FQ-PCR法检测21份MRSA菌株与细菌培养鉴定的符合率为100%，说明直接用MRSA菌株进行FQ-PCR 检测，实验的准确度明显提高。

综上所述，FQ-PCR法的灵敏度高、特异性强，检测方便、简单、快捷，可以在标本接收后2～3 h内出结果，可迅速对临床治疗做出积极的引导，并可以满足医院感染防控24 h内检测患者入院时是否携带MRSA的要求。

[1]Matouskova I,Janout V.Current knowledge of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub,2008,152(2):191-202.

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[3]施瑜．耐甲氧西林葡萄球菌检测方法评价[J]．检验医学与临床，2008，5(24)：1517-1518．[4]Sturenburg E.Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from Clinical samples:methods,effectiveness and cost considerations[Z],2009.

[5]Clinical Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-third informational supplement.M100-S23[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2013.

[6]Balakuntla J,Prabhakara S,Arakere G.Novel rearrangements in the staphylococcal cassette chromosome mec type V elements of Indian ST772 and ST672 methicillin risistant staphylococcus aureus strains[J]．PloS One,2014，9(4)：e94293-e94295．

[7]徐伟红，徐斌．耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因检测及耐药性分析[J]．国际检验医学杂志，2013，34(12)：37-39．

[8]郝崇华，万艳红，裴世静，等．耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实验室诊断方法[J]．中国药物与临床，2013，13(9)：1174-1176．

[9]牟晓峰，赵自云．实时荧光定量PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立与应用评价[J]．中华医院感染学杂志，2011，21(19)：4185-4187．

Evaluation of FQ-PCR method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus MecA gene*

OUHong-ling,CHENFeng-hua,WANGYan,ZHANGQiao-yun,WANGXin-ru△

(DepartmentofClinicalLaboratory，GeneralHospitaloftheSecondArtillery，Beijing100088，China)

Objective To evaluate the reliability of fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) MecA resistant gene.Methods A total of 125 clinical specimens were collected from June 2013 to December 2013,including 40 blood specimens,52 sputum specimens,33 specimens of wound secretions.FQ-PCR method and bacteria identification were used to detect all the specimens,and then analyze the consistent rate of results,sensitivity and specifity.Results The sensitivity of FQ-PCR method was 0.159 pg/μL,the specificity of FQ-PCR in detecting bacterial strain cultured and identified was100%,and the consistent rate with the results of clinical samples was 97.6%.Conclusion FQ-PCR method is more convenient,fast in detecting MecA gene of MRSA,and sensitivity,specificity are ideal,the consistent rate with bacterial identification result is high,so could be used widely in clinical applications.

methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MecA gene; fluorescent quantitative polymerase chain reaction; bacterial identification

全军十二五面上课题(CWS11J205)。

欧红玲，女，硕士，主管技师，主要从事分子生物学研究。△

,E-mail：wangxinru@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.002

A

1672-9455(2015)04-0436-03

2014-10-11

2014-12-10)