DNA测序法检测CYP2C19基因多态性指导氯吡格雷用药的临床价值*

吴 薇，韩瑞玲，王丽岳，李 艳△

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060；2.武汉大学人民医院临床分子诊断中心，湖北武汉 430060；3.武汉市普仁医院心血管内科，湖北武汉 430081)



·论 著·

DNA测序法检测CYP2C19基因多态性指导氯吡格雷用药的临床价值*

吴 薇1,2，韩瑞玲1,2，王丽岳3，李 艳1,2△

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060；2.武汉大学人民医院临床分子诊断中心，湖北武汉 430060；3.武汉市普仁医院心血管内科，湖北武汉 430081)

目的 评估DNA测序法检测细胞色素氧化酶P450 2C19(CYP2C19)多态性以指导氯吡格雷临床用药。 方法 选取2010年11月至2013年11月武汉大学人民医院心血管内科诊断为急性冠状动脉综合征，并首次接受经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)的140例患者为研究对象，随机分为试验组及对照组各70例。试验组采集外周血标本并提取基因组DNA，根据已知的CYP2C19基因序列，设计针对CYP2C19*2、CYP2C19*3位点的特异性引物，聚合酶链反应扩增包含CYP2C19基因多态性位点的DNA片段；并以DNA测序法进行鉴定，分析不同CYP2C19基因型在试验组患者中的分布频率。对照组患者使用氯吡格雷药物但未检测相关基因。比较两组患者随访过程中发生冠状动脉血栓事件的差异。结果 DNA测序结果显示，试验组中共有4种基因型组合被检测到：*1/*1(636GG，681GG)、*1/*2(636GG，681GA)、*2/*2(636GG，681AA)、*1/*3(636GA，681GG)，分布频率分别为33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)，而*3/*3(636AA，681GG)和*2/*3(636GA，681GA)未检测到。经基因型指导氯吡格雷用药的试验组患者发生支架冠状动脉血栓事件的比例为0.0%，明显低于对照组的7.1%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 基因型指导氯吡格雷用药有助于患者用药剂量的调整，可降低冠状动脉血栓事件的发生率。

氯吡格雷； 细胞色素氧化酶P450 2C19； DNA测序

药物洗脱支架内血栓是冠状动脉支架术后患者严重的并发症之一，严重者可导致死亡[1]。研究发现，氯吡格雷抵抗是导致此事件发生的重要原因之一，而氯吡格雷抵抗和细胞色素氧化酶P450 2C19(CYP2C19)基因变异相关[2]。CYP2C19代谢表型呈现遗传多态性，表现为强代谢型(正常野生型)和弱代谢型，且存在显著的地区间和个体间差异[3-4]。在中国人群中最常见的CYP2C19酶代谢缺陷等位基因型主要为CYP2C19*2及CYP2C19*3[5]。由于临床应用氯吡格雷出现的不良事件大多与患者基因多态性有关，因此，通过检测CYP2C19基因型来了解患者氯吡格雷的代谢能力，实现临床个体化用药显得尤为重要。另外，研究不同地区人群CYP2C19基因多态性也具有非常重要的临床意义。本研究根据CYP2C19基因多态性位点设计特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)及DNA测序法来鉴定CYP2C19*2、CYP2C19*3在湖北地区汉族人群中的分布，并观察基因型指导氯吡格雷用药的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年11月至2013年11月武汉大学人民医院心内科诊断为急性冠状动脉综合征、病情稳定并首次接受经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)的当地汉族患者140例为研究对象，平均分为试验组和对照组各70例。PCI由两位高年资医生协同完成，手术过程中完成完全血运重建。所有患者均采用双联抗血小板治疗(拜阿司匹林和氯吡格雷)、强化他汀调脂及其他抗心绞痛辅助治疗。两组患者均排除：(1)消化道溃疡等出血高危人群；(2)急诊PCI患者；(3)PCI过程中出现夹层动脉瘤等严重并发症的患者；(4)用药初期出现过敏反应而不能坚持服药的患者。试验组患者在首次接受PCI术前采肘静脉血2～3 mL，经乙二胺四乙酸抗凝管4 ℃保存备用。

1.2 仪器与试剂 ABI9700型基因扩增仪、ABI3500测序仪均购自美国Applied Biosystem公司。细胞/血液基因组DNA快速提取试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司。DNA胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)购自美国Axygen公司。所用离心管及枪头均由美国Axygen公司提供。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 试验组患者根据基因型指导氯吡格雷用药。强代谢型患者PCI术后氯吡格雷75 mg服用一年。弱代谢型患者PCI术后氯吡格雷150～225 mg服用一年，或选用其他抗凝血药物。对照组患者术前、术中和术后治疗与试验组惟一不同在于不接受基因型检测，PCI术后仅经验性给予氯吡格雷75 mg服用一年。

1.3.2 CYP2C19基因多态性引物设计 参照Genbank中CYP2C19基因序列，采用Vector NTI 11.0软件设计引物。针对CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型位点分别设计1对特异性引物，扩增的PCR产物将包含此特定基因型位点，结果见表1。

表1 CYP2C19*2、CYP2C19*3扩增引物

1.3.3 外周血基因组DNA提取 参照厂家说明书，采用细胞/血液基因组DNA快速提取试剂盒提取患者外周血基因组DNA后于-80 ℃保存备用。

1.3.4 DNA测序包含CYP2C19基因多态性位点的PCR产物 PCR扩增产物经回收、纯化后，用表1中引物分别对包含CYP2C19基因多态性位点的DNA片段进行测序并用ABI3500测序仪和Sequencing Analysis 5.2软件分析扩增产物，以鉴定患者CYP2C19基因型。

1.3.5 PCR及琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 用MBI Fermentas 2×PCR mix PCR反应液进行PCR扩增，PCR扩增条件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 50 s， 72 ℃ 60 s，35个循环；最后 72 ℃ 10 min。PCR结束后，PCR扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳分析，依据PCR产物片段大小，初步检测PCR的特异性。为防止PCR污染，PCR前处理和后处理在不同隔离区内进行,各工作区均有一定的隔离，操作器材专用。另外，PCR扩增所需试剂均在装有紫外灯的超净工作台配制和分装。操作时设阴阳性对照和空白对照，以验证PCR的可靠性，及协助判断扩增系统的可信性。

1.3.6 DNA测序包含CYP2C19基因多态性位点的PCR产物 PCR扩增产物经回收、纯化后，用表1中引物分别对包含CYP2C19基因多态性位点的DNA片段进行测序并用ABI3500测序仪和Sequencing Analysis 5.2软件分析扩增产物，以鉴定患者CYP2C19基因型。

1.3.7 患者随访 所有患者PCI术后一周左右出院，出院后继续坚持双联抗血小板、强化他汀调脂及其他必要的辅助治疗。每个月门诊随访，监测患者血常规、血脂、肝功能、心电图的变化。若患者有胸痛、胸闷等怀疑心绞痛症状，随时入院检查。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验；以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DNA测序鉴别CYP2C19基因多态性结果 试验组患者CYP2C19基因型经PCR扩增纯化后，随即测序反应和序列分析。结果显示PCR扩增的70例患者DNA片段的确包含CYP2C19基因多态性位点。另外，测序结果可清楚地显示患者CYP2C19的基因型，结果见图1。

2.2 CYP2C19基因多态性在试验组中的分布 湖北地区70例汉族患者中，DNA测序结果可见CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因型。*1/*1(636GG，681GG)、*1/*2(636GG，681GA)、*2/*2(636GG，681AA)、*1/*3(636GA，681GG)，*3/*3(636AA，681GG)和*2/*3(636GA，681GA)的患者比率分别为33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)、0例(0.0%)和0例(0.0%)。

2.3 两组患者心血管事件发生率比较 试验组在8个月的随访中，未发现急性血栓形成相关事件；2例患者死亡，均与冠心病无关(车祸、肿瘤)；2例患者分别出现上消化道出血和颅内出血，短期停用抗血小板药物后再次服用。对照组在一年随访中共出现5例支架内血栓形成的心梗患者，其中死亡1例；另有1例出现与支架无关的心梗，治疗后好转。试验组冠状动脉血栓事件发生率(0.0%)明显低于对照组(7.1%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：箭头所指为多态性位点；A图示CYP2C19*2杂合突变；B图示CYP2C19*2纯合突变；C图示CYP2C19*3杂合突变。

图1 CYP2C19基因多态性测序图

3 讨 论

氯吡格雷是目前国际上使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠状动脉综合征、冠状动脉支架术和冠心病的预防，可降低心血管疾病患者心脏病发作及死亡的风险[6]。氯吡格雷本身并不具备抗血小板活性，必须在体内通过CYP系统代谢成活性成分，而在众多相关酶中，CYP2C19成为人们关注的焦点[7]。CYP2C19野生型，即CYP2C19*1型的患者对氯吡格雷的代谢功能完好，而CYP2C19*2，*3，*4，*5，*6，*7和*8突变型都是氯吡格雷弱代谢的基因类型[8]，中国人群中以CYP2C19*2和*3型最为常见。因此在应用氯吡格雷前，检测患者的基因多态性对于其在临床安全有效应用方面有着重要作用。

本研究建立了一个以DNA测序技术为基础的可准确有效鉴别患者CYP2C19基因型的临床检验方法。此方法使得临床大量检测CYP2C19基因多态性成为可能，未来可大大提高氯吡格雷的用药安全和有效性。另外，由于CYP2C19不仅代谢氯吡格雷，同样也代谢其他药物，如苯妥英、丙戊酸和奥美拉唑[9-11]，因此通过本方法检测CYP2C19基因型也可帮助指导这些药物的使用。

通过分析CYP2C19基因多态性在试验组患者中的分布情况发现，湖北地区汉族人群中CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因型均存在。CYP2C19*1/*1(强代谢型)、CYP2C19*1/*2(弱代谢型)、CYP2C19*1/*3(弱代谢型)、CYP2C19*2/*2(弱代谢型)、CYP2C19*3/*3(弱代谢型)和CYP2C19*2/*3(弱代谢型)的患者比率分别为33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)、0例(0.0%)、0例(0.0%)，分析结果与其他研究小组关于中国汉族人群的统计结果类似[12]。更为重要的是，利用DNA测序法检测CYP2C19基因型，加大氯吡格雷弱代谢型患者的用药剂量，或改用其他抗凝血药物后，试验组发生冠状动脉血栓的概率明显低于对照组。因此进行CYP2C19基因的突变检测对于实现氯吡格雷的个性化用药，降低心血管疾病的病死率具有重要的临床意义。

虽然本研究已初步显示基因型检测对指导氯吡格雷用药具有重要的临床价值，但不足之处在于样本量相对较少，尚需进一步扩大样本加以验证。

[1]Buonamici P,Marcucci R,Migliorini A,et al.Impact of platelet reactivity after clopidogrel administration on drug-eluting stent thrombosis[J].J Am Coll Cardiol,2007,49(24):2312-2317.

[2]Hulot JS,Bura A,Villard E,et al.Cytochrome P450 2C19 loss-of-function polymorphism is a major determinant of clopidogrel responsiveness in healthy subjects[J].Blood,2006,108(7):2244-2247.

[3]Jia DM,Chen ZB,Zhang MJ,et al.CYP2C19 polymorphisms and antiplatelet effects of clopidogrel in acute ischemic stroke in China[J].Stroke,2013,44(6):1717-1719.

[4]何楠，周宏灏．CYP2C19遗传多态性的研究进展[J]．生理科学进展，2003，34(2)：171-174．

[5]Xiao ZS,Goldstein JA,Xie HG,et al.Differences in the incidence of the CYP2C19 polymorphism affecting the S-mephenytoin phenotype in Chinese Han and Bai populations and identification of a new rare CYP2C19 mutant allele[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,281(1):604-609.

[6]Faxon DP,Freedman JE.Facts and controversies of aspirin and clopidogrel therapy[J].Am Heart J,2009,157(3):412-422.

[7]Hariharan S,Southworth MR,Madabushi R.Clopidogrel,CYP2C19 and proton pump inhibitors:what we know and what it means[J].J Clin Pharmacol,2014,54(8):884-888.

[8]Osnabrugge RL,Head SJ,Zijlstra F,et al.A systematic review and critical assessment of 11 discordant meta-analyses on reduced-function CYP2C19 genotype and risk of adverse clinical outcomes in clopidogrel users[J].Genet Med,2014，19(10):1038-1042.

[9]Pestka EL,Hale AM,Johnson BL,et al.Cytochrome P450 testing for better psychiatric care[J].J Psychosoc Nurs Ment Health Serv,2007,45(10):15-18.

[10]Bertilsson L.Metabolism of antidepressant and neuroleptic drugs by cytochrome p450:clinical and interethnic aspects[J].Clin Pharmacol Ther,2007,82(5):606-609.

[11]于洁，邵宏，聂小燕，等．CYP2C19基因多态性对癫痫患者丙戊酸血药浓度的影响[J]．中国临床药理学与治疗学，2007，12(6)：700-704．

[12]向瑜，崔鲂，邓济甦，等．重庆地区汉族人群CYP2C19基因多态性分布与不同种族间比较[J]．临床检验杂志，2013，31(8)：629-631．

Clinical value of DNA sequencing for CYP2C19 polymorphisms detection on the application of clopidogrel*

WUWei1，2，HANRui-Ling1，2，WANGLi-yue3,LIYan1，2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，2.MolecularDiagnosticCenter，People′sHospitalofWuhanUniversity，Hubei，Wuhan430060,China;3.DepartmentofCardiovascularMedicine,PurenHospitalofWuhan,WuhanHebei430081,China)

Objective To evaluate the clinical application value of detectiing Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) polymorphisms by DNA sequencing in clopidogrel application.Methods From November 2010 to November 2013,a total of 140 blood samples were randomly collected in patients with acute coronary syndrome and treated with percutaneous coronary intervention (PCI) for the first time in the department of cardiology in People′s Hospital of Wuhan University.Aaa the patients were divided as control group and study group randomly,70 patients in each group.According to known gene sequences of CYP2C19,specific primers were synthesized to genotype the CYP2C19*2 and CYP2C19*3 alleles through polymerase chain reaction (PCR) amplification and DNA sequencing.Meanwhile,the distribution of these alleles in the study group was analyzed.The control group didn′t do genotype but use clopidogrel.The incidence rates of coronary artery thrombosis in the process of follow-up between the two groups was compared.Results DNA sequencing results showed that 4 kinds of gene type were detected including *1/*1(636GG,681GG),*1/*2(636GG,681GA),*2/*2(636GG,681AA) and *1/*3(636GA,681GG).The distribution rates of them were 47.1%,41.4%,5.7% and 5.7% respectively.However,*3/*3(636AA,681GG) and *2/*3(636GA,681GA) were not found.Besides,the incidence rate of coronary artery thrombosis in the study group(0.0%) was significant lower than that of the control group (7.1%)(P<0.05).Conclusion It is help to use the detection of CYP2C19 polymorphism by DNA sequencing guiding the dosage of clopidogrel,and could reduce the occurrence of coronary artery thrombosis.

clopidogrel； cytochrome P450 2C19； DNA sequencing

国家自然科学基金资助项目(81200389)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20120141120077)；教育部中央高校基本科研业务专项基金资助项目(121069)；湖北省自然基金资助项目(2010CDB8701)。

吴薇，女，博士，主管技师，主要从事临床分子诊断研究。△

,E-mail：yanlitf@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.001

A

1672-9455(2015)04-0433-03

2014-07-30

2014-09-28)