PD－L1在结肠癌患者CD4＋CD25hi CD127low／－调节性T细胞中的表达及其临床意义＊

梁姣姣，居颂文，高志欣

（南京医科大学附属苏州医院北区：1．消化系疾病与营养研究中心；2．消化科，苏州215008）

调节性CD4＋CD25＋T（regulatory T，CD4＋CD25＋Treg）细胞是机体重要的负性免疫调节成分。Treg细胞约占外周CD4＋细胞的5%～10%，这类细胞数量虽少但功能强大在机体免疫稳态维持、肿瘤免疫等方面发挥着重要作用［1－5］。FOXP3在Treg细胞发育和功能中起关键作用，是CD4＋CD25＋Treg细胞特异性的标记［6］。新近研究发现，健康人外周血T淋巴细胞中CD127和Foxp3的表达呈负相关，CD127可以识别CD4＋CD25＋Treg细胞与活化的T细胞，因此，根据细胞表面CD127表达，可将Treg细胞定义CD4＋CD25hiCD127low／－

Treg细胞［7－8］。Treg细胞通过细胞间接触依赖机制发挥作用或分泌IL－10和TGF－β1等细胞因子，抑制CD4＋CD25－T细胞、CD8＋T细胞和树突状细胞等其他免疫细胞的活性和功能［5］。PD－L1是新发现的B7家族中的共刺激分子，PD－L1与T细胞表面的相应配体PD－1结合，传递负反馈信号，抑制T细胞的激活和效应应答，肿瘤细胞表达的PD－L1能抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的抗肿瘤活性，从而逃避免疫攻击［9－11］。而 PD－L1在肿瘤患者 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg 细胞上的表达及临床意义目前研究较少，本研究探讨了结肠癌患者外周血中PD－L1在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上的表达及其与肿瘤病理分期及患者荷瘤状况之间的相关性。

1 资料与方法

1．1 一般资料 分别采集结肠癌患者血样47份，其中男25份，女22份，年龄31～82岁，平均62．5岁，同时采集健康人血样10份作对照，其中男5份，女5份，年龄26～80岁，平均49．2岁。患者样本来自南京医科大学附属苏州医院北区和苏州大学附属第二人民医院。所有患者样本在化学治疗、放射治疗之前采集。

1．2 方法 采用聚蔗糖－泛影葡胺（Ficoll－Hypaque）密度梯度离心法从肝素全血中分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。各种合适滴度的单克隆抗体与单细胞悬液在4℃条件下孵育染色20min。同时用同型对照的单克隆抗体孵育单细胞悬液，以判断非特异性染色的程度。然后应用FACSCalibur流式细胞仪上机检测。

1．3 统计学处理 采用SPSS13．0软件进行数据分析，计量资料用x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间采用χ2检验。检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 结肠癌患者外周血中 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上PD－L1的表达 结肠癌患者以及健康志愿者的PBMCs分别标记抗不同的荧光抗体（CD4－FITC单抗、CD25－PECy5单抗、CD127－APC单抗、PD－L1－PE单抗，BD公司）。流式细胞术分析CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞的含量及其PD－L1的表达。与健康志愿者比较，结肠癌患者的CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞的百分含量明显增加（P＜0．01），见图1，且CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞PD－L1分子的表达明显上升（P＜0．01），见图2。进一步的分析表明，PD－L1分子在Ⅲ期和Ⅳ期患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上的表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，见图3。

2．2 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg PD－L1的表达与肿瘤患者的荷瘤状况相关性 结肠癌患者手术前和手术后3周的PBMCs分别标记 CD4－FITC单抗、CD25－PECy5单抗、CD127－APC单抗、PD－L1－PE单抗，流式细胞仪分析 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上PD－L1的表达。研究结果表明，术后结肠癌患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg上PD－L1的表达较术前明显下降（P＜0．05），见图4。

图1 结肠癌患者外周血中CD4＋CD25hi CD127low／－Treg细胞含量明显增加

图2 PD－L1分子在结肠癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表达升高

图3 PD－L1分子在不同分期结肠癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg细胞中表达变化

图4 手术后PD－L1分子在结肠癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表达下降

3 讨 论

诸多报道表明，Treg细胞的增加是导致肿瘤逃逸的重要因素。例如，在非小细胞肺癌和卵巢癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中Treg的含量明显增多［12－13］。在胃肠道肿瘤患者中CD4＋CD25－T细胞明显减少而Treg细胞数量增多，且Treg细胞数量的增高与较差的预后和较低的生存率高度相关［14］。Treg数量的增加在头颈部鳞癌、肝癌、多发性骨髓瘤等许多肿瘤患者中也均有报道［15－16］。本研究也证实，在结肠癌患者外周血中CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞的百分含量明显增加。进一步的研究表明CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上PD－L1表达明显升高。统计分析结果表明，晚期患者PD－L1的表达水平明显高于早期患者。手术后患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上PD－L1表达明显降低。PD－L1分子在Treg细胞上的表达水平与肿瘤分期密切相关，随着肿瘤的缩小或切除，PD－L1分子的表达水平会随之不同程度下降，说明PD－L1表达水平与肿瘤负荷相关。PD－L1是重要的免疫抑制分子，PDL1与PD－1结合后抑制T细胞、B细胞、NK细胞功能，从而介导肿瘤免疫逃逸。因此，本研究结果提示，PD－L1分子在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞上的表达水平升高可能导致了CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞免疫抑制功能的提高，进而增强了对其他免疫细胞的抗肿瘤能力的抑制，而随着肿瘤的进展PD－L1分子的表达水平随之升高，CD4＋CD25hiCD127low／－Treg细胞的免疫抑制功能进一步增强。因此，PD－L1分子在Treg细胞上表达水平的监测对评价结肠癌治疗效果、疾病进展及预后具有重要价值。

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