17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

陈美霓，郭巍，赵菊梅，魏晓丽

(1.延安大学医学院实验中心，延安 716000 ；2.延安大学医学院附属医院泌尿外科)



·基础研究·

17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

陈美霓1，郭巍2，赵菊梅1，魏晓丽1

(1.延安大学医学院实验中心，延安 716000 ；2.延安大学医学院附属医院泌尿外科)

[摘要]目的观察17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17-AAG)对肝癌HepG2细胞增凋亡的影响,并探讨其机制。方法采用吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色，通过荧光显微镜观察HepG2细胞凋亡情况；采用流式细胞仪分析细胞凋亡率的变化；逆转录聚合酶链反应检测17-AAG处理肝癌HepG2细胞前后bax和bcl-2的mRNA蛋白表达。结果AO/EB荧光染色结果显示对照组呈均匀绿色荧光，实验组随着药物浓度的增加，呈红色荧光凋亡细胞逐渐增多；流式细胞仪结果显示17-AAG促进肝癌HepG2细胞凋亡；RT-PCR结果显示17-AAG能使bax的mRNA蛋白表达水平升高、bcl-2的mRNA蛋白表达水平下降，其作用呈剂量效应关系。结论17-AAG具有促进肝癌HepG2凋亡作用，其机制可能与其上调bax、下调bcl-2蛋白表达有关。

[关键词]肝肿瘤;Hep G2细胞;细胞凋亡;bcl-2相关X蛋白质;bcl-X蛋白质

WHO癌症研究中心(IARC)统计，2008年肝癌是全球第5位常见癌症，其病死率占所有癌症死亡率的第3位[1]。17-丙烯胺-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)是热休克蛋白90(HSP90)抑制剂，对多种肿瘤细胞具有抑制生长、诱导凋亡的作用。本文通过体外实验探讨17-AAG对HepG2细胞凋亡的作用，并通过检测bax和bcl-2mRNA蛋白的变化对其作用机制做了初步研究。

1材料和方法

1.1材料(1)实验细胞：人肝癌细胞株HepG2由延安大学医学院实验中心实验室提供。(2)主要试剂：RPMI-1640培养基(赛默飞世尔公司)，17-AAG、氮唑蓝、二甲亚砜及碘化丙啶(美国Sigma公司)，AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BD pharmingen 公司)，Trizol(南京凯基生物技术有限公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，Bcl-2、Bax、β-actin引物由上海生工设计合成，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(中国Fermentas 公司)。(3)主要仪器：荧光倒置显微镜及CCD(日本Nikon)，凝胶成像系统GENE(英国Syngene公司)，流式细胞仪FACS Calibur(美国Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养人肝癌HepG2细胞于RPMI-1640培养液中培养，内含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，置37 ℃、5%CO2培养箱中。实验选取对数生长期细胞进行研究。实验设健康对照组和实验组，血清浓度均为5%，实验组17-AAG浓度为0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L。

1.2.2吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双重荧光染色观察细胞形态取对数生长期的HepG2细胞，以2×105/mL的密度接种于内有干净无菌盖玻片的6孔板中24 h后，加入含药培养基，并设对照组。培养48 h后弃培养液，PBS 洗涤3次后滴浓度为100 μg/mL的 AO/EB混合液于爬片上30 s，夹出盖玻片置于载玻片上，用波长为490 nm处的荧光显微镜观察拍照。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率将HepG2细胞制成细胞悬液以2×105/mL的密度接种6孔板内，细胞贴壁后设实验组和对照组作用48 h，胰酶消化离心收集细胞，按照AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒使用说明染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)收集实验组和对照组处理48h的HepG2细胞，按照Trizol试剂盒说明书操作提取总RNA,取少量样品用紫外分光光度仪在A260nm/A280nm处测定其浓度和纯度，并合成cDNA，合成样品于-80 ℃保存。取cDNA反应原液2 μL，DEPC水39 μL，dNTP 1 μL，10×PCRbuffer 5 μL，上游、下游引物各1 μL，Taq聚合酶1 μL，总体积为50 μL。PCR反应条件：预变性为94 ℃ 3 min，30个循环程序为94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃60 s，72 ℃延伸5 min。引物序列、大小及退火温度见表1。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，以β-actin 作为内对照，用凝胶成像系统进行拍照及图像分析。

表1　被检测基因所使用的引物序列

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行分析，各组间差异比较采用t检验。

2结果

2.1吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双重荧光染色观察细胞形态17-AAG作用于HepG2细胞48 h后对活细胞进行AO/EB双染染色显示，健康对照组细胞可见细胞核呈绿色荧光，细胞核形态完整，大小一致，着色均匀；实验组可见凋亡细胞和死亡细胞。凋亡细胞核呈染色增强，均匀一致固缩状或片段状的红色荧光，死亡细胞核形态结构正常，呈橘红色荧光。随着药物浓度的增加，可见细胞数逐渐减少，凋亡细胞和死亡细胞逐渐增多，见图1。

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞术分析显示，HepG2细胞在17-AAG作用48 h后，细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高，与对照组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2　17-AAG作用HepG2细胞48 h的凋亡率(n=4)

注：与对照组比较,aP<0.05

2.3RT-PCR检测bax和bcl-2的mRNA表达RT-PCR结果显示，与健康对照组比较，17-AAG作用的HepG2细胞中bax mRNA表达随着药物浓度的增加而增加，bcl-2 mRNA表达逐渐减少，bax和bcl-2的mRNA表达具有剂量相关性，实验组不同浓度药物对HepG2细胞bax和bcl-2 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，图2。实验组17-AAG浓度为0.63、1.25、2.5、5.0μmol/L的bcl-2/ bax比值分别为0.701、0.551、0.474、0.433，均低于健康对照组的比值1.366，呈一定的剂量关系。

表3　HepG2细胞的bax、bcl-2 mRNA表达水平

注：与对照组比较，aP<0.05

3讨论

HSP90是众多热休克蛋白的一种，是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一，在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象保护细胞生命活动，它具有特殊的分子伴侣功能[2-3]。HSP90在众多肿瘤中呈高表达状态，并随着肿瘤侵袭逐渐加深，HSP90的表达也逐步增加[4]。而肿瘤细胞中的HSP90过表达、蓄积，几乎控制了所有恶性细胞表型组成成分及细胞信号传导通路[5]。HSP90还参与肿瘤血管的生长侵袭及转移，在药物耐受﹑增加肿瘤细胞辐射敏感性及抗凋亡信号通路活化等起重要作用[6-8]。Hsp90已经成为肿瘤治疗的新靶点[9]。

17-AAG是HSP90特异抑制剂。研究证实17-AAG能与肿瘤来源的HSP90靶向结合，优先杀死肿瘤细胞，同时通过阻断多个信号通路的多个靶点，使肿瘤细胞周期停滞、诱导凋亡，并且可以增加肿瘤对其他化疗药物的敏感性[10-11]。本实验发现AO/EB双重荧光染色下，17-AAG处理的HepG2细胞可见体积小、核浓缩、强荧光的红色凋亡小体，随着药物浓度的增加，凋亡小体也逐渐增多，并出现细胞核形态正常的橘红色死亡细胞。经细胞流式仪检测结果证实，17-AAG有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡，随着时间延长，凋亡作用明显增强的作用。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，是多基因严格控制的过程。其中bcl-2家族是细胞凋亡的重要调节因子，其中bax与bcl-2是一对互相拮抗的蛋白。bcl-2蛋白属于线粒体蛋白，通过阻止线粒体里细胞色素C 释放，抑制caspase蛋白酶的活化[12]；同时抑制Ca2+的跨膜流动，抑制PT孔的开放[13]，从而抑制细胞凋亡。bax蛋白通过二聚体形式改变线粒体膜的通透性，诱导细胞凋亡[14]。本次试验RT-PCR结果显示，不同浓度的17-AAG作用HepG2细胞后，bax蛋白的表达随着药物浓度的上升而上调，而bcl-2蛋白则相反。有实验研究表明，Bax和bcl-2可以形成同源或异源bcl-2/bax二聚体，其比值增大时抑制细胞凋亡，当比值减小时加速细胞凋亡[15]。本研究表明，17-AAG作用HepG2细胞后，可随药物浓度的增加而降低bcl-2/bax的比值，从而促进HepG2细胞的凋亡。

综上所述，HSP90抑制剂17-AAG能诱导HepG2细胞发生凋亡，其机制可能上调bax蛋白的表达、下调bcl-2蛋白的表达，并同时下调bcl-2/bax比值有关。

(本文图1,2见插图1-1)

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Effects of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on apoptosis of human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 in vivo

CHENMeini*,GUOWei,ZHAOJumei,WEIXiaoli

(*CenterofMedicalExperiment,Yan'anMedicalCollege,Yan'anUniversity,Yan'an716000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on cell apoptosis of Human hepatoma carcinoma cell Lines HepG2,and explore the possible mechanism.MethodsCellular morphological alterations were observed after AO/EB staining;the apoptosis and cell cycle of HepG2 cells were assayed by flow cytometry;the expression of apotosis related proteins bax and bcl-2 in HepG2 cells treated with 17-AAG were detected by RT-PCR．ResultsThe result of AO/EB double staining showed that the control homogeneously were green fluorescence;the experimental group were red fluorescent,and the red fluorescent was increased with drug concentration gradually;Flow cytometry result showed 17-AAG promote hepatocellular carcinoma HepG2 cell apoptosis;RT-PCR results showed that 17-AAG can increased bax mRNA expression levels of protein,decreased the BCL-2 mRNA protein expression levels,the effect was related with drug dose.Conclusion17-AAG can inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells,and the mechanism may be related to its effect in up-regulating bax protein expression and down-regulating the BCL-2 protein expression.

[Key words]Liver neoplasms;Hep G2 Cells;Apoptosis;bcl-2-Associated X Protein;bcl-X Protein

(收稿日期：2014-08-22)

Corresponding author:GUO Wei，Email:15756560@qq.com

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.016

通信作者：郭巍，主治医师，Email：15756560@qq.com

作者简介：陈美霓，实验师，Email：25677435@qq.com

基金项目：陕西省教育厅科学研究项目(12JK0713)；延安市科学技术研究发展计划项目(2013-KW15)； 2012年延安大学自然科学专项基金项目