急性一氧化碳中毒对大鼠少突胶质前体细胞的影响

孙瑞佼，郭大志，李航，李铭鑫，胡慧军，潘晓雯

急性一氧化碳中毒(acute arbon monoxide poisoning，ACOP)是国内外最常见的意外中毒之一[1]，研究证实，脑白质的脱髓鞘改变是最常见、最主要的病理改变[2]，但髓鞘脱失机制不详。在中枢神经系统中，少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)向少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)的分化是髓鞘形成的关键步骤，也是髓鞘损伤后再生修复的主要来源[3]。本研究应用免疫组织化学染色和Western Blot观察ACOP大鼠中枢神经系统髓鞘损伤后髓鞘标志物髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)和OPCs特异性细胞标志物硫酸软骨素蛋白多糖NG2表达的变化，为探讨ACOP后中枢神经系统髓鞘脱失机制提供一定的实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只(军事医学科学院实验动物中心提供)，清洁级，9～10周龄，体质量200～250g，于12h明-暗交替、室温18～20℃的动物房适应性饲养1周。自由进食标准大鼠饲料及普通自来水。②主要仪器和设备：轮转切片机(德国Leica公司)，组织匀浆器(BIOSPEC公司)，低温水平离心机(美国)，垂直电泳槽(BIO-RAD公司)，半干转移电泳仪(BIO-RAD公司)，凝胶成像分析系统(美国)，全自动显微照相机(日本Olympus)。

1.2 方法 参照Fechter[4]及王耀宏等[5]的研究，利用分次腹腔注射CO法制作ACOP大鼠模型。参考前期预实验结果，预计染毒死亡率约50%，故36只SD大鼠中按电脑随机数选取24只进行染毒，分次腹腔内注射纯品CO气体(99.9%，燕山石化)，首次剂量120ml/kg，后以半量追加注射3次，每次间隔4h。其余12只作为对照组按同样方案注射空气。染毒后每隔15～20min观察1次大鼠变化。造模结束后从存活大鼠中随机选取12只作为染毒组纳入实验；正常对照组注射空气后无死亡，全部纳入。

1.3 检测指标 ①免疫组织化学染色：在染毒后第1d、3d，2组各随机取3只大鼠，腹腔注射20%乌拉坦(0.7 ml/100g体质量)麻醉，灌注，取脑，4%中性甲醛液固定2h，30%蔗糖溶液脱水7d，浸蜡，包埋，切片(厚度15um)，石蜡切片脱蜡后，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，经微波对抗原进行热修复后加入一抗MBP、NG2，0.01mol/L PBS清洗后，添加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵箱孵育30min，PBS清洗后加入ABC复合物，37℃孵箱孵育30min。DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封片。②组织蛋白样本制备及Western Blot分析：在相同实验节点2组各随机取3只大鼠，处死后取脑，加入5ml细胞裂解液及蛋白酶抑制剂充分匀浆，再加蛋白上样液，95℃加热5min，离心后取上清，每孔加样5ul，用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，经转膜及封闭后，将膜移入含抗MBP、NG2多克隆抗体的一抗反应液中，4℃过夜，洗膜后加入二抗，室温避光缓摇60min，洗膜后扫描，摄片。③图像分析： MBP、NG2免疫组织化学染色结果：在光镜下采集图像，每个标本取5个视野，应用Imagic-Pro 5.1图像分析软件测定髓鞘、MBP、NG2的积分光密度值(integral optical density，IOD)。Western Blot以β-actin为内参，计算目的蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 染毒后表现 大鼠腹腔注射CO后中毒症状与王耀宏等[5]文献报道类似，5～10min出现烦躁、撞笼，15min陆续出现少动、四肢瘫软、抽搐、昏迷，黏膜及肢端皮肤呈樱桃红色，部分发生角弓反张。上述症状体征持续至末次染毒后6h逐渐消失。造模后CO染毒组存活14只，死亡10只，尸检发现大鼠皮肤黏膜及肝脏呈典型“樱桃红”样改变，心脏、肝脏及脾脏等脏器重度充血伴散在出血点，脑组织充血水肿严重。对照组大鼠无异常表现，无死亡。

2.2 免疫组织化学染色结果 大鼠ACOP后1d，MBP表达轻度下降，与对照组比较IOD值差异无统计学意义；3d后MBP表达进一步下降，与对照组比较IOD值差异有统计学意义(P<0.05)，见图1；大鼠ACOP后1d，NG2表达减少，与对照组比较IOD值差异无统计学意义，3d时进一步减少，与对照组比较IOD值显著下降(P<0.05)，见图2。局部放大后观察，对照组可见数目较多的NG2阳性细胞，胞体小，呈圆形或椭圆形，从胞体向四周放射状伸出多数突起。染毒3d后OPCs数量减少，细胞形态异常，胞体缩小，突起减少，见图3。具体数据见表1。

2.3 Wester Blot检测结果 2组大鼠脑组织中均有MBP、NG2表达，相对分子质量MBP为18500、NG2为300000。MBP、NG2在对照组中正常表达，染毒组染毒1d后MBP及NG2表达均减少，3d时进一步减少，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，5。

a.染毒组1d b.染毒组3d

c.对照组1d d.对照组3d

图1a～d 大鼠脑组织MBP免疫组织化学染色结果(×40)

a.染毒组1d b.染毒组3d

c.对照组1d d.对照组3d

图2a～d 大鼠脑组织NG2免疫组织化学染色结果(×40)

a.染毒后3d b.正常对照

图3a～b 3d大鼠脑组织NG2免疫组织化学染色局部放大(×60)

组别nMBP1d3dNG21d3d对照组317.74±0.8318.24±1.0314.95±0.7514.56±0.83染毒组316.24±0.8915.15±0.75a13.22±0.6610.85±0.93a

与对照组比较，aP<0.05

对照组 中毒1d 中毒3d

图4 大鼠脑组织MBP表达的Western Blot电泳图

对照组 中毒1d 中毒3d

图5 大鼠脑组织NG2表达的Western Blot电泳图

3 讨论

建立合适的动物染毒模型是进行相关中毒研究的基础，目前常用ACOP模型的造模方法有吸入染毒法和腹腔注射染毒法。温韬等[6]在Fechter基础上改良的分次腹腔注射染毒法，具有操作简单、染毒程度容易控制等优点，注射后血碳氧血红蛋白可迅速升高至所需水平，并引起明显中毒症状，神经系统损伤及生化指标改变均与临床所及CO中毒表现一致。因此本研究选用此方法进行造模。但此方法在染毒过程中有一定的死亡率，死亡率随注射剂量增加而增大，且死亡大都发生于首次注射后。王耀宏等[5]研究发现，对体质量240～280g的大鼠，腹腔注射CO半数致死剂量为146ml/kg，95%可信范围129～165ml/kg。在保证大鼠出现明显中毒效应，且死亡率可接受的前提下，我们选用首次注射剂量为120ml/kg。王耀宏等[5]报道此剂量大鼠死亡率约30%，而我们在前期预实验中发现死亡率约50%，此差异推测与本研究所选用大鼠体质量较小(200～250g)，耐受性相对较差有关。实验中对24只大鼠进行染毒，死亡10只，实际死亡率41.67%。

ACOP后脑白质脱髓鞘的机制尚不明确，在其它脑白质脱髓鞘疾病，如缺血缺氧性脑病、多发性硬化症的研究中发现，缺血缺氧后星形细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和中性白细胞被激活后释放大量的炎性细胞因子、蛋白酶、NO 和氧自由基，这些物质均可直接或间接地造成OLs损伤，最终导致脑白质缺血性脱髓鞘病理改变[7-10]；多发性硬化症尽管机制不明，但其主要病理进程基本取得共识[11]，包括原发性脱髓鞘，此时很少有OLs的损伤；脱髓鞘过程中OLs的广泛丢失；原发性OLs损伤并导致继发性脱髓鞘；大量的巨噬细胞被激活，引起非选择性的组织损伤，不仅累及髓鞘还涉及轴突和星形胶质细胞。ACOP对人体的损伤机制非常复杂，既往研究已证明存在与上述脑缺血缺氧、多发性硬化等疾病类似的缺氧损害、免疫损伤、氧化应激、炎症损伤等损伤机制[12-13]。除此以外，CO还特有细胞毒性作用，能直接作用于线粒体造成细胞损伤[14]。ACOP后中枢神经系统脱髓鞘是否与OLs受损有关，目前尚无研究报道。从本实验结果看，中毒后1d即可看到MBP表达较正常对照组减少，3d时进一步减少，证明ACOP后大鼠中枢神经系统发生脱髓鞘改变。

在中枢神经系统中，OPCs向OLs的分化是髓鞘形成的关键步骤，也是髓鞘损伤后再生修复的主要来源[15]。大量研究表明在各种损伤因素导致脱髓鞘病变后，OPCs开始增殖并迁移至脱髓鞘区域，分化为OLs包裹脱髓鞘轴突形成新的髓鞘。另外有研究发现在缺血损伤区域存活下来的OLs不能进行分化和髓鞘再生，有高度迁移和分化潜能的OPCs形成的新生少突胶质细胞是髓鞘再生的来源[16]。作为髓鞘脱失后修复的主要来源，OPCs受损会对髓鞘修复造成影响，导致修复不良或不能修复。近年来研究发现，OPCs对缺血缺氧等刺激同样敏感，脑缺血引起的能量耗竭、氧化应激同样会损伤OPCs[17-18]。另外，OPCs膜上分布有丰富的非N-甲基-D-天冬氨酸(non-N-methyl-D-aspartic acid，non-NMDA)受体，脑缺血后细胞间隙积聚的大量兴奋性氨基酸将激活non-NMDA受体，损伤OPCs[19]。在慢性多发性硬化患者中，OPCs很少分化，这与患者后期髓鞘修复失败相吻合[20]。从本实验结果来看，ACOP后1d 即可看到NG2表达减少，3d时进一步减少；与正常对照组比较，中毒后3d时OPCs数量明显减少，残存细胞形态异常，胞体缩小，突起减少，表明ACOP对OPCs造成损伤。此外有研究显示，老年大鼠脑内的OPCs移动能力较弱，细胞形态与成年大鼠不同[21]，而临床上观察到在ACOP患者中高龄患者髓鞘脱失持续时间长，恢复慢，迟发脑病的发生率明显高于年轻患者[22]。

综上，ACOP在造成中枢神经系统脱髓鞘的同时，也对OPCs细胞造成损伤。推测OPCs受损后不能及时分化成OLs修复脱失的髓鞘，是后续发生迟发脑病的可能机制之一，有待进一步研究证实。

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