肾综合征出血热患者血浆白细胞介素-18水平动态变化研究

王军宁，郭维娟，杜 虹，于海涛，蒋 伟，白雪帆，王平忠

肾综合征出血热（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）是由汉坦病毒引起的以发热、出血、PLT减少及不同程度肾损伤为临床特征的急性传染病[1]。典型病例有5期临床经过，分别为发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期。根据疾病的严重程度，可分为轻型、中型、重型和危重型。本病的基本病理变化是全身广泛性毛细血管损伤及通透性增加，但其具体致病机制至今尚未阐明。已有大量研究证实机体的固有免疫及适应性免疫在HFRS发病机制中发挥了重要作用，肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-4、IL-8和干扰素（interferon,IFN）γ等细胞因子在HFRS发病机制中发挥重要作用[2-3]。IL-18是一种促炎症细胞因子，与机体多种炎症反应密切相关[4-5]，但IL-18在HFRS患者不同病期和临床型中的动态变化尚未见报道。为了探讨IL-18在HFRS发病中的作用，我们检测了不同病期及不同临床型HFRS患者血浆IL－18水平变化，并进一步探讨其与病程及病情的相关性，以期为HFRS发病机制研究提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取第四军医大学唐都医院2011年10月—2014年1月收治的81例HFRS患者不同病期血样145份。所有患者经血清学检查HFRS特异性IgG和IgM阳性而确诊，并排除合并其他病毒性感染、肾脏疾病、自身免疫相关性疾病及肿瘤性疾病，治疗期间未用激素及其他免疫抑制剂。另选取15名来自本科室的志愿者为健康对照。共收集患者轻型12例，中型21例，重型25例，危重型23例。以及收集发热/低血压期血样40份，少尿期血样35份，多尿期血样49份，恢复期血样21份。根据疾病过程特点，把发热/低血压期和少尿期归为急性期，把多尿期和恢复期归为恢复期[6]。本项研究通过第四军医大学唐都医院伦理委员会审批同意，所有患者都签署知情同意书。

1.2 研究方法 无菌采集患者3ml静脉血，1500 r/min离心10min，收集血浆并分装，－80℃保存。采用购买于美国R&D公司的ELISA试剂盒测定血浆中的IL－18水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行，每个样本做2个复孔，取平均值。同时登记采血当天患者的 WBC、PLT、BUN、CRE（由本院检验科检测）。

1.3 统计学处理 用SPSS 17.0软件和GraphPad Prism 5软件进行数据分析。计量资料呈非正态分布，用中位数表示，多组间比较用Kruskal－Wallis H检验比较总体差异，用Nemenyi秩和检验进行两两比较。急性期轻型/中型组与重型/危重型组IL－18水平呈正态分布且组间方差齐，2组比较用成组t检验。IL－18与其他检测指标的相关性分析用Spearman相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者4个病期IL－18水平变化 患者IL－18水平的中位数在发热/低血压期、少尿期、多尿期、恢复期和正常对照值分别为 811、1008、581、485、167 pg/ml。其中发热/低血压期、少尿期、多尿期及恢复期IL－18水平均高于正常对照值（P均＜0.05）。发热/低血压期与少尿期IL－18水平差异无统计学意义，但此2期均高于多尿期和恢复期（P均＜0.05）；多尿期与恢复期IL－18水平差异无统计学意义。说明患者IL－18水平在发热/低血压期和少尿期上升到最高水平，到多尿期和恢复期明显下降，但是仍然高于正常对照值。见图1。

图1 81例4个病期血浆IL-18水平变化发热/低血压期、少尿期、多尿期、恢复期及正常对照的样本量分别为 40、35、49、21和 15；5组比较用 Kruskal－Wallis H 检验，H=70.990，P=0.000，组间多重比较用 Nemenyi秩和检验；*P＜0.05，**P＜0.001Figure 1 Changes of p lasma IL-18 level in 81 HFRS patients at 4 phases

2.2 急性期和恢复期IL－18水平变化 将4个病期合并为急性期和恢复期2个病期，发现血浆IL－18水平在急性期和恢复期均高于正常对照值（P均＜0.05），并且急性期高于恢复期（P＜0.05）。说明患者IL－18水平在急性期处于最高水平，到恢复期明显下降，但是仍然未降到正常值范围。见图2。

图2 患者急性期和恢复期IL-18水平变化3 组比较用 Kruskal－Wallis H检验，H=58.220，P=0.000，组间多重比较用Nemenyi秩和检验，***P＜0.001Figure 2 Changes of IL-18 level in patients at acute and convalescent phases

2.3 4种临床型患者在急性期和恢复期IL－18水平变化 4种临床型患者IL－18水平在急性期和恢复期均高于正常值（P均＜0.05），轻型患者急性期与恢复期比较差异无统计意义（P＞0.05），而中型、重型和危重型患者急性期均高于恢复期（P均＜0.05）。见图3。

图3 4种临床型患者急性期和恢复期IL-18水平变化A.轻型；B.中型；C.重型；D.危重型。3 组比较用 Kruskal－Wallis H 检验，A，H=23.980，P=0.000；B，H=39.800，P=0.000；C，H=40.040，P=0.000；D，H=38.190，P=0.000。组间多重比较用 Nemenyi秩和检验，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001Figure 3 Changes of IL-18 level in 4 clinical types of HFRS patients at acute and convalescent phases

2.4 患者急性期IL－18水平变化 将75例急性期4种临床型合并为重型/危重型和轻型/中型，发现在急性期，重型/危重型IL－18水平较轻型/中型升高更为明显（P＜0.05）。32例轻型/中型患者中仅有5例（15.6%）IL－18水平超过1000 pg/ml，然而43例重型/危重型患者中有22例（51.5%）超过1000 pg/ml，超过率是轻型/中型的3.3倍。见图4。

图4 急性期患者IL-18水平在轻型/中型组与重型/危重型组的比较2组之间比较用成组t检验，t=3.527，**P＜0.010Figure 4 Changes of IL-18 level in HFRS patients at acute phase between them ild/moderate group and the severe/critical group

2.5 IL－18与其他检测指标相关性分析 患者IL－18水平与反映疾病进程和严重程度的指标WBC和BUN呈中等正相关（图5A、5C），与CRE呈弱正相关（图5D），与PLT呈中等负相关（图5B）。见图5。

图5 患者血浆IL-18与WBC、PLT、BUN和CRE的相关性Figure 5 Correlations between plasma IL-18 level and WBC,PLT,BUN and CRE

3 讨 论

HFRS是由汉坦病毒感染引起的一种人兽共患传染病，主要临床表现为发热、低血压休克、PLT减少、出血和肾损伤。血管内皮细胞是病毒感染的主要靶细胞[1]。可引起全身小血管和毛细血管的广泛性损伤，其基本病理改变为血浆外渗。近年发现，汉坦病毒可通过β3－整合素受体破坏血管内皮细胞间紧密连接，使钙黏蛋白内化分解，从而增强血管内皮细胞对内皮细胞生长因子的敏感性，使血管通透性增加[7－8]。但是单独血管内皮紧密连接的损伤也难以解释病毒感染后的血管通透性升高。目前普遍的观点认为，HFRS的发病机制可能是多因素共同作用的结果。其中汉坦病毒感染后免疫介导的病理损伤是主要的诱导因素。体内外研究均表明汉坦病毒感染可诱导炎症细胞因子/趋化因子的高水平表达[1－2]，它们在HFRS发病机制中可能发挥了重要作用。

IL－18 属 IL－1 超家族成员[9]，是 Okamura等[10]于1995年从灭活的丙酸杆菌致敏后注射脂多糖的裸鼠肝细胞中分离并克隆出来的一种细胞因子，是主要由单核细胞/巨噬细胞产生的一种多生物活性的前炎性细胞因子，可诱导急性期炎性反应的产生，促进多种免疫细胞的分化及活化,同时可诱导T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生IFNγ，对固有免疫及适应性免疫均有调节作用。其作用已在糖尿病、多发性硬化症、神经性皮炎、类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病、败血症及AIDS等感染性疾病发病机制研究中有所报道[9，11-12]。

HFRS患者细胞因子/趋化因子的变化及与疾病严重程度的关系有诸多报道。Saksida等[13]研究发现血浆IL-10、IFNγ和TNF-α几乎在所有HFRS早期都升高，重症患者IL-10和TNF-α与正常对照值比较也明显升高。这表明促炎症因子和调节性细胞因子的失衡在HFRS发病中起着重要作用。

本研究检测了 HFRS 患者 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-8、IFN γ 和 IP-10 水平[2]，发现血浆 TNF-α、IL-6、IFNγ、IL-8和IP-10浓度与正常对照值相比明显升高，最高浓度峰一般在发热期、低血压期及少尿期，并与疾病严重程度相一致。这表明汉坦病毒感染产生大量炎症因子，导致超强免疫反应，在疾病早期可能引起“细胞因子风暴”，在调节免疫和清除病毒的同时，导致免疫损伤。

我们的研究表明，HFRS患者血浆IL-18水平在发热期开始升高，在少尿期达峰值，同时肾损伤也是开始于发热期，少尿期损伤最为严重。当进入多尿期，随着尿量的增加，肾功能逐渐恢复正常，IL-18水平开始下降。恢复期IL-18水平与正常对照相比差异无统计学意义，此期患者的肾功能也恢复正常。相关分析还发现HFRS患者血浆IL-18水平与BUN、CRE呈中等程度正相关，BUN和CRE是肾损伤程度的主要标志，这些结果表明HFRS患者血浆IL-18在一定程度上反映了疾病的严重程度。已有研究表明血浆IL-18水平可预测肝移植后急性肾损伤，与糖尿病肾病密切相关，还可预测危重型患者急性肾损伤肾脏替代治疗的短期预后[14-17]。

HFRS病毒血症是短暂的，在发热期末汉坦病毒基本被机体清除[18]。血浆IL-18在发热期开始升高，少尿期达最高峰，并与疾病严重程度密切相关。这表明血浆IL-18在清除汉坦病毒方面的作用非常微弱，主要是通过炎症介质介导的免疫反应参与HFRS的病理过程。IL-18可刺激T淋巴细胞的增殖，促进辅助性T细胞免疫应答，诱导IFNγ产生，增强FasL介导的细胞毒效应，另一方面IL-18直接作用于自然杀伤细胞，增强其自然杀伤活性[19]，从而在HFRS的发病过程中起了重要作用。

本研究发现IL-18水平不仅与疾病进程有关，而且重型/危重型患者在急性期明显高于轻型/中型，同时血浆IL-18水平与WBC和PLT水平密切相关。WBC也是机体固有免疫充分活化的标志，PLT与疾病严重程度密切相关，并可预测急性肾损伤[20]。这表明IL-18血浆浓度与疾病严重程度密切相关。

综上所述，IL-18在HFRS急性期明显升高，在不同病期和临床型之间有明显变化，并且与反映疾病严重程度的临床指标密切相关。因此，IL-18可用作临床判断病情变化的一个参考指标。此外，如果在HFRS早期阻断IL-18的分泌，或者干预IL-18与其受体结合，可能会减轻疾病的严重程度、缩短病程，为HFRS的治疗提供更多的措施。但是IL-18在HFRS中的致病机制尚不明确，还有待进一步研究。

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