酶联免疫吸附分析法测定猪、鸡粪便中11种β-受体激动剂残留

2015-03-13 08:08周悦榕李丹妮顾欣严凤吴剑平张鑫
中国兽药杂志 2015年8期
关键词:布特标准偏差激动剂

周悦榕,李丹妮,顾欣,严凤,吴剑平,张鑫

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)



酶联免疫吸附分析法测定猪、鸡粪便中11种β-受体激动剂残留

周悦榕,李丹妮,顾欣,严凤,吴剑平,张鑫

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

以市售β2-受体激动剂酶联免疫检测试剂盒为基础,建立了可同时测定猪、鸡粪便中克仑特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、卡布特罗、马喷特罗、吡布特罗、西马特罗、西布特罗、克仑潘特11种β2-受体激动剂的酶联免疫吸附(ELISA)分析法。该方法对猪、鸡粪便样品的检出限为5 ng/g,猪粪便样品的添加回收率为57.3%~247.4%,鸡粪便样品的添加回收率为89.3%~177.3%,猪粪便样品重复测定结果的相对标准偏差为0.3%~14.3%,鸡粪便样品重复测定结果的相对标准偏差为0.2%~23.5%。

β2-受体激动剂;多残留;猪粪便;鸡粪便;酶联免疫吸附分析法

β2-受体激动剂属苯乙胺类药物。因其具有“脂肪再分配效应”,可显著提高饲料转化率与提高酮体瘦肉率而被非法用于畜牧生产[1-2]。人类经食物链摄入含药物残留的动物源性食品会引发肌肉震颤、心律失常、眩晕乏力等中毒症状危及人类健康[3]。我国相继出台了农业部176号公告[4]、193号公告[5]、235号公告[6]、1519号公告[7]等一系列法律法规,力争从动物饮用水、饲料等源头遏制其非法使用。

一直以来,动物肌肉、内脏、奶、蛋、尿液与血浆是兽药残留检测中常见的样品类型,但均存在采集工序繁琐、采样风险与成本高、样品再利用率较低等问题。故近年来,探索新型活体检材(如:毛发[8]、唾液[9]、视网膜[10])逐渐成为兽药残留分析研究的新方向。目前,已有从动物粪便中测定抗生素残留的相关报道[11,12],但尚没有将其作为违禁物质残留测定对象的相关报道。动物粪便是另一种重要的动物代谢产物载体,其采集方式更灵活便捷,可操作性强。据本实验室前期研究表明部分药物在猪粪便中代谢残留量明显高于猪尿中的残留量。故粪便样品可否作为兽药残留分析研究的新型活体检材需进一步研究。

目前,有关动物源性食品中β2-受体激动剂类药物分析方法的报道已有很多,主要有胶体金免疫层析法[13]、酶联免疫吸附分析法[14-15]、气相色谱-质谱法[16]、液相色谱法[17]、离子色谱[18]、毛细管电泳法[19]与液相色谱-串联质谱法[20]等。其中酶联免疫吸附分析法因其简便、灵敏、快速、大通量等优势被广泛用于日常监测和筛查工作。但目前报道的β2-受体激动剂酶联免疫检测法大部分仅限于单个药物。故建立一个便捷、快速、高效的β2-受体激动剂多残留酶联免疫检测方法显得尤为必要。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 BioTek ELX808酶标仪,带450 nm波长滤光片,美国伯腾仪器公司,美国;BioTek Gen 5.0TM数据分析软件,美国伯腾仪器公司,美国;PL202-L感量为0.01g电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,上海;AB135-S感量为0.00001g电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,上海;AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷冻离心机,美国BECKMAN COULTER公司,美国;KS-260漩涡振荡器,德国IKA公司,德国;MILLIPORE A10超纯水系统,密理博(上海)贸易有限公司,上海;TARGIN VX-Ш多管涡旋振荡器,北京踏棉科技有限公司,北京。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品 硫酸特布他林(Terbutaline Hemisulfate,纯度≥ 100 %,批号:095K1629)购自sigma公司、盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride,纯度≥ 98.5 %,批号:20223)、沙丁胺醇(Salbutamol,纯度≥ 99.00 %,批号:20618)均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司、溴布特罗(Brombuterol,纯度≥ 100 %,批号:080415)、盐酸马布特罗(Mabuterol Hydrochloride,纯度≥ 99 %,批号:120805)、醋酸卡布特罗(Carbuterol Acetate,纯度98.5 %,批号:261533)、盐酸马喷特罗(Mapenterol Hydrochloride,纯度≥ 99 %,批号:061005)、醋酸吡布特罗(Pirbuterol Acetate,纯度99.9 %,批号:241741)、西马特罗(Cimaterol,纯度≥ 99 %,批号:071105)、西布特罗(Cimbuterol,纯度≥100 %,批号:241418)、克仑潘特盐酸盐(Clenpenterol Hydrochloride,纯度99.5 %,批号:241840)均购自witega公司。

1.2.2 试剂 β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒(批号:269534,英国朗道实验诊断有限公司);氢氧化钠、盐酸(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);甲醇 (色谱纯,美国Merck公司);实验用水均为一级水。

1.2.3 标准贮备液的配制 分别精密称取11种β2-受体激动剂标准品含药物质量为0.01 g(精确至0.00001 g),用适量甲醇溶解并定容10 mL,配制成含药物浓度各为1 mg/mL的标准储备液,置于4℃冷藏保存,有效期6个月。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理步骤 称取猪、鸡粪便样品(2±0.01) g于50 mL离心管中,准确加入20 mL 0.1 mol/L盐酸溶液提取,充分混匀,振荡10 min,离心5 min (9000 r/min)。取出全部提取液于另一支50 mL离心管中,用1 mol/L氢氧化钠溶液调节样液的pH值范围为7~9,离心5 min (9000 r/min),取50 μL上清液供β2-受体激动剂的酶联免疫试剂盒检测。

1.3.2 试剂盒检测步骤 参见英国朗道实验诊断有限公司β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒产品说明书。

1.3.3 检测限和定量限 将不同来源的猪、鸡粪便空白样品各20份,按照1.3.1和1.3.2确定的方法处理并测定,计算猪粪、鸡粪空白样品测定平均值,并对应加上3倍标准差即为β2-受体激动剂酶联免疫分析筛选检测方法的检测限[21]。方法定量限的确定过程参照《关于发布<兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案审查技术资料要求>和<兽药残留酶联免疫试剂(盒)参考评价标准>的通知》[21]的要求。

1.3.4 准确度和精密度 向猪、鸡粪便空白样品中分别准确加入一定质量浓度的11种β2-受体激动剂标准品,添加浓度为分别为定量限和2倍定量限[21]。添加样品按照1.3.1和1.3.2确定的方法处理并测定,批内相同的质量浓度水平做5次平行实验,重复3个批次,计算11种β2-受体激动剂的加标回收率(R / %)及批内、批间的相对标准偏差

(RSD/ %)。11种β2-受体激动剂的加标回收率应40%,批内相对标准偏差应30%,批间相对标准偏差应40%[21]。

2 结果

2.1 标准曲线 质量浓度为0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 ng/mL的系列标准溶液,按1.3.2的试剂盒检测步骤测定,使用BioTek Gen 5.0TM数据分析软件采用4参数拟合方程,以克仑特罗标准品浓度的对数为横坐标,以450 nm波长处的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线见图1和表1,IC50数值为0.456 ng/mL。

图1 猪、鸡粪便的ELISA标准曲线

曲线名称曲线公式ABCDR2IC50值/(ng·mL-1)标准曲线Y=(A-D)/(1+(X/C)^B)+D1.120.9060.4560.180.9970.456

2.2 50 %抑制浓度(IC50)范围 重复测定20条标准曲线,统计IC50测定值,测定结果见表2。确定IC50的变化范围为0.456 ~ 0.903 ng/mL。

表2 20条标准曲线IC50浓度统计表(单位:ng·mL-1)

2.3 交叉反应率 酶联免疫吸附分析法的交叉反应实验反映了该检测方法在一个多元混合体系中检测出目标化合物的能力,即抗体是否对特定分析物表现显著的特异性,能够区别干扰成分与特定分析物结构上的细微变化。通过比较待测物与其结构或功能类似物之间的测定交叉反应率考察检测方法的特异性[22]。本试验中11种β2-受体激动剂与克仑特罗抗体、沙丁胺醇抗体的交叉反应率参见英国朗道实验诊断有限公司β2-受体激动剂酶联免疫试剂盒产品说明书见表3。由产品说明书提供的结果得知试剂盒所用抗体与11种β2-受体激动剂均产生交叉反应,故该抗体可用于11种β2-受体激动剂的多残留检测。

表3 11种β2-受体激动剂与克仑特罗抗体、

2.4 检测限和定量限 选择猪、鸡粪便空白样品各20份考察检测限见表4。并考察了以5 ng/g为猪粪便样品中克仑特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、卡布特罗、马喷特罗、克仑潘特、西布特罗的定量限,以10 ng/g为猪粪便样品中吡布特罗、西马特罗的定量限。以5 ng/g为鸡粪便样品中克仑特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、克仑潘特、西布特罗的定量限,以10 ng/g为鸡粪便样品中卡布特罗、马喷特罗、吡布特罗、西马特罗的定量限。结果表明,猪、鸡粪便样品的添加回收率均大于40%,满足《关于发布<兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案审查技术资料要求>和<兽药残留酶联免疫试剂(盒)参考评价标准>的通知》[21]的要求。

2.5 准确度和精密度 将11种β2-受体激动剂标准品分别以定量限和2倍定量限的添加浓度添加至猪、鸡粪便空白样品中,结果见表5。结果表明,猪粪便添加样品回收率范围在57.3%~247.4%之间,批内相对标准偏差(RSD/n=5)均在0.3%~14.3%之间,批间相对标准偏差(RSD/n=3)均在1.2%~17.4%之间,鸡粪便添加样品回收率范围在89.3%~177.3% 之间,批内相对标准偏差(RSD/n=5)均在0.2%~23.5%之间,批间相对标准偏差(RSD/n=3)均在0.3%~20.5%之间。

表5 猪、鸡粪便中11种β2-受体激动剂批内、批间回收率及相对标准偏差

2.6 基质效应 准确称取空白猪、鸡粪便各(2 ± 0.01) g,按照1.3.1确定的样品前处理方法处理,得到空白猪、鸡粪便基质液。分别向其中加入适量的11种β2-受体激动剂,配制成含药物浓度为4 ng/mL 的基质匹配标准溶液。同时,用0.1 mol/L盐酸溶液(经1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7 ~ 9)稀释标准品中间液配制成浓度相同的标准溶液。按照1.3.2确定的检测步骤进行5次平行试验,计算两测定值之比(Matrix Effect/%)的平均值,以考察猪、鸡粪便对11种β2-受体激动剂的基质效应,结果见表6。

2.7 实际样品的测定 随机抽样上海市奉贤区、崇明县不同养殖场的猪粪便样品30份,鸡粪便样品44份,采用本实验建立的酶联免疫分析筛选检测方法与液相色谱-串联质谱法进行测定,每份样品进行2次平行测定,结果取平均值。实际样品经酶联免疫分析筛选法测定后发现1份猪粪便样品为阳性,检测结果为6.53 ng/g,2份鸡粪便样品为阳性,检测结果分别为6.03 ng/g和6.44 ng/g。所有实际样品再经本实验室开发的畜禽粪便中β2-受体激动剂的液相色谱-串联质谱检测法确证后表明,所有的实际样品均为阴性。因此,该法检测猪、鸡粪便样品中11种β2-受体激动剂的假阳性率分别为3.3 %和4.5 %。

表6 鸡粪便和猪粪便对11种β2-受体激动剂的

3 讨论与小结

3.1 样品前处理步骤的确定 试验充分考虑了β2-受体激动剂的化学性质,及对保护酶联免疫试剂盒内包被的抗体的影响,考察了2种不同的样品提取步骤(提取步骤Ⅰ:先加2 mL 1 moL/L盐酸水溶液,后加18 mL水,充分混匀并振荡;提取步骤Ⅱ:直接加20 mL 0.1 moL/L盐酸水溶液,充分混匀并振荡)的提取效果和3种不同的上样pH值(pH值为7、8、9)对酶联免疫法检测的影响,以确定样品前处理步骤。研究采用克仑特罗、沙丁胺醇、特布他林40.0 ng/g的鸡粪便添加样品,结果表明不同的提取方式和不同的上样pH值对三种化合物提取回收率没有显著的影响,且回收率均能满足检测的要求。因此,考虑到简化试验步骤,兼顾提高试验效能,选择使用Ⅱ号提取步骤和范围为7~9的上样pH值。

3.2 基质效应 在仪器分析中经常需要复杂繁琐的样品前处理过程,基于抗体对分析物的选择性,酶联免疫分析方法通常不需要严格的提取和净化过程。但是基质对酶联免疫分析的干扰可能很大。大多数干扰会影响分析物与抗体的结合,或者改变酶标记物的活性,从而影响所建立的酶联免疫方法的灵敏度和重现性[22]。结果表明,猪粪便基质中克仑特罗、沙丁胺醇、卡布特罗、西布特罗为基质减弱,其余化合物为基质增强。鸡粪便基质中11种β2-受体激动剂均表现为基质增强。

研究在现有的市售β2-受体激动剂酶联免疫检测体系基础上建立了一套简便、快速且高效的猪、鸡粪便中11种β2-受体激动剂多残留的酶联免疫吸附检测方法,适用于对大量畜禽粪便样品中β2-受体激动剂残留的快速筛查。对于疑似阳性样品需利用液相色谱法、液相色谱-串联质谱法或气相色谱-质谱法等定量方法做进一步的确证。

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[21]中华人民共和国农业部农医发[2005]17号. 关于发布《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案审查技术资料要求》和《兽药残

留酶联免疫试剂(盒)参考评价标准》的通知[S].

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(编 辑:陈希)

Determination of 11 β2-Agonists Residue in Swine and Chicken Manure by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ZHOU Yue-rong, LI Dan-ni, GU Xin, Yan Fen, WU Jian-ping, ZHANG Xin

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China)

A method for simultaneously detecting clenbuterol hydrochloride, brombuterol, salbutamol, terbutaline hemisulfate, mabuterol hydrochloride, carbuterol acetate, mapenterol hydrochloride, pirbuterol acetate, cimaterol, cimbuterol, clenpenterol hydrochloridein swine and chicken manure by ELISA was developed in accordance with commercial β2-Agonists-Testing ELISA kit.Furthermore, the limit of determination was 5 ng/g.The recoveries of the method in swine manure were from 57.3% to 247.4% withRSDranging from 0.3% to 14.3%, and the recoveries of the method in chicken manure were from 89.3% to 177.3% withRSDranging from 0.2% to 23.5%.

β2-agonists ;mulit- residues ; swine manure ; chicken manure ; ELISA

上海市市级农口系统青年人才成长计划[沪农青字(2014)第2-2号]

周悦榕,助理畜牧师,从事兽药残留检测与方法开发。E-mail:zhou_yuerong@qq.com

2015-05-18

A

1002-1280 (2015) 08-0039-07

S859.84

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