硫源对高温厌氧产氢菌Caldicellulosiruptor changbaicum发酵产氢的影响

于雷等

摘要：以从长白山温泉中筛选到的高温厌氧产氢菌Caldicellulosiruptor changbaicum为菌种，研究硫源对其发酵纤维素产氢的影响。先以Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3为硫源进行单因素试验，考察硫源对菌株生长和产氢的影响。然后在生物反应器中分别以Na2S和Na2S、Na2S2O3混合物为硫源进行厌氧发酵试验。结果在以Na2S ∶Na2S2O3=1 ∶2的混合物为产氢菌提供硫元素时，发酵液pH值呈稳定下降趋势，产气稳定时的平均速率为90～100 mL/（L·h），氢气的转化效率达到7.73 mmol/g VS，说明Na2S、Na2S2O3混合硫源有利于该高温厌氧菌发酵纤维素产氢。

关键词：高温厌氧产氢菌；Caldicellulosiruptor changbaicum；纤维素；硫源；氢气；生物反应器；发酵产氢

中图分类号： TQ920.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0326-03

收稿日期：2014-03-20

基金项目：吉林省科技发展规划项目（编号：20100563）。

作者简介：于雷（1973—），男，吉林长春人，博士，副教授，研究方向为食品科学与发酵工程。E-mail：leiyujl@sina.com。进入21世纪以来，从石油、煤炭等矿产资源开采量的不断上升以及储存量的不断减小，到人们对可替代能源的追求与探索，能源问题已经成为了全世界共同关注的焦点问题[1]。氢气作为一种可燃的气体，有着诸多方面的优点。例如环保，氢气燃烧后的产物除了水之外没有其他任何物质，是绝对无污染的；另外，氢气的燃烧值最高，达到了3 042 cals/m3，且燃烧的热转化效率也很高。因此，关于制氢技术的研究成为了近年来人们关注的热点[2]。

在所有的制氢技术中，生物制氢以其反应条件温和、节能、可再生，还可以治理工业污染等诸多优点，逐渐成为了研究的热门领域[3]。生物制氢主要分为两大类，一类为光合微生物发酵；另一类为厌氧微生物发酵。其中，厌氧微生物发酵生物质制氢具有治理污染、环保和高产能等特点，有着非常广阔的开发前景，越来越多的厌氧产氢菌已经被发现并应用到富含纤维素污染物的处理当中[4]。高温厌氧微生物在所有发酵产氢的厌氧微生物中，由于其发酵环境的温度较高，发酵过程中产生的气体不需要再经过后继操作就可以快速溢出，因此在一定程度上降低了生产成本。而且氢气的快速溢出，也减小了氢气对发酵过程的抑制作用，从另一角度提升了发酵制氢的速率[5]。相对于其他厌氧产氢菌，高温菌更易得到高的产氢效率[6-7]，理论最大产氢量可以达到每消耗1 mol/L菌葡萄糖产4 mol/L H2[8]，因此利用高温厌氧菌发酵产氢具有较大的生产潜力。

在利用高温厌氧产氢菌制氢的过程，影响其生长和产氢的因素很多[9]，如培养温度、培养基pH值、培养所利用碳源、氮源的种类和金属离子的影响等等。除上述因素以外，硫源对该类细菌的生长和制氢有着非常大的影响，该类细菌的生理生化特性表明硫元素为新陈代谢过程中的电子受体，因此硫元素是该类细菌生长所必须的元素之一[10-11]。本试验主要研究硫源对分离自长白山温泉的高温厌氧产氢菌Caldicellulosiruptor changbaicum的生长以及产氢的影响，从而为其发酵产氢的应用提供理论和技术依据。

1材料与方法

1.1菌种及来源

高温厌氧产氢菌由吉林大学分子酶学教育部重点实验室提供，通过16S rRNA全序列比对及系统发育学分析，发现这株菌属于热解纤维素果汁杆菌属，命名为Caldicellulosiruptor changbaicum。

1.2培养基

传代培养基：0.33 g NH4Cl，0.33 g KH2PO4，0.33 g KCl，0.33 g MgCl2·6H2O，0.20 g CaCl2，1.0 mL 金属离子，10.0 mL 维生素，1.5 g NaHCO3，0.5 g Na2S·9H2O，0.5 g刃天青，0.5 g酵母粉，5.0 g滤纸，1 000 mL去离子水。灭菌条件：115 ℃，20 min。其中金属离子、维生素、NaHCO3、Na2S·9H2O、刃天青和滤纸单独灭菌，在传代时再分别加入；滤纸用组织捣碎机捣碎后再灭菌后利用。

金属离子的配制：10.00 mL HCl（25%），1.5 g FeCl2·4H2O，70.00 mg ZnCl2，10.00 mg MgCl2·4H2O，6.00 g H3BO3，190.00 mg CoCl2·6H2O，2.00 mg CuCl2·H2O，24 mg NiCl2·6H2O，36 g NaMoO4，990 mL 去离子水。

维生素的配制：2.00 mg 维生素H，2.00 mg维生素B9，10.00 mg维生素B6，5.00 mg维生素B1-HCl·2H2O，5.00 mg 维生素B2，5.00 mg烟酸，5.00 mg泛酸盐，0.10 mg维生素B12，5.00 mg对氨基苯甲酸，5.00 mg ZnSO4，1 000.00 mL 去离子水。

发酵培养基：发酵培养基与传代培养基除硫源不相同以外，其他成分均相同。

1.3硫源单因素试验

利用250 mL的厌氧瓶进行培养，培养基的体积为 200 mL，接种量为3%，利用N2、CO2体积比为4 ∶1的混合气来提供厌氧环境，（75±1） ℃、120 r/min振荡培养。

试验分别利用含相同硫元素浓度的Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3来提供硫环境，并以不加任何硫元素的培养基为对照，来研究高温厌氧菌的生长及产氢的现象。

1.4生物反应器发酵endprint

如图1所示，利用2.0 L的生物反应器进行发酵产氢试验，发酵培养基的体积为1.7 L，接种量为12%[12]，利用连接75 ℃循环水浴的皮管套控制发酵温度，利用磁力搅拌器对发酵液进行搅拌，转速为300 r/min；培养基的碳源为0.5%的滤纸。通过“1.3”的试验结果可以得到发酵产氢最佳的硫化合物或者混合物，然后以它们为硫源进行发酵试验，从而确定最佳的硫源。

1.5分析方法

发酵液中还原糖利用DNS法测定[13]；发酵产生的气体（H2、CO2、CH4等）利用气相色谱法测定[14]，具体条件：用的柱子为3 m Hayesep Q 色谱柱，并利用热导检测器。进样针和柱子的温度分别为110、130 ℃。

2结果与分析

2.1高温厌氧菌对硫源的选择性

在相同的试验条件下分别利用不同硫源对高温菌进行培养，结果如表1所示。

试验结果表明，对于高温厌氧产氢菌Cal. changbaicum来说，硫是该类细菌正常生长所必需的元素，在硫元素缺乏的条件下，细菌不能生长。由表1可见，Na2S和Na2S2O3是硫元素的最佳提供者，细菌长势良好。因此，在后面的生物反应器发酵试验中，就以这2种化合物为发酵培养基提供硫元素。

但是在利用Na2S2O3为单一的硫源、培养基排氧时间与添加其他硫元素的培养基相同时，培养基的颜色为红色，说明培养基中含有氧气，厌氧菌无法生长。如果继续使用Na2S2O3为硫源，那么对培养基进行排氧处理的时间就要相应地加长，一般排氧时间会在1 h左右，因此从排氧时间角度考虑，单独利用Na2S2O3硫源不十分理想。而当培养基中添加Na2S时，排氧的时间只需要5 min左右，可见Na2S可以起到快速去除培养基中痕氧的作用。因此，在下面的反应器发酵过程中，分别选择Na2S和Na2S、Na2S2O3的混合物作为硫源进行对比发酵试验。

2.2生物反应器发酵过程中硫源的选择

2.2.1以Na2S为硫源发酵产氢以Na2S为唯一的硫源，利用0.5%滤纸为碳源进行发酵产氢试验，发酵过程中产气速率与发酵液pH值的变化如图2所示。

由图2可知，当以滤纸作碳源、Na2S为唯一的硫源时，厌氧菌一直没有得到很好的发酵效果，产气速率一直维持在 15 mL/（L·h） 左右，发酵产生的气体总量只有1 200 mL左右。

在发酵的前3 h，有大量的气体溢出，经测定其中大部分为H2S，进而使得培养基的硫元素大量溢出，致使硫元素缺失，从而导致该菌无法正常生长。

另外，大量的H2S溢出也导致了在发酵的起始阶段发酵液的pH值由7.0左右快速升高到8.4。虽然之后发酵液的pH值有所下降，但也都在7.6以上，而该菌最适pH值在 6.5～7.5 之间，使得该菌在偏碱性的pH条件下不能够快速生长并产气。

目前国外高温厌氧菌发酵产氢的研究中，培养基硫源大多是直接由Na2S来提供的，其他硫化合物基本上都没有用到。笔者所在课题组在试验过程中发现单独使用Na2S作为培养基的硫源并没有得到较好的产氢效果。

2.2.2以Na2S和Na2S2O3的混合物为硫源发酵产氢由“2.2.1”的试验结果可知，硫环境对发酵产氢起着非常重要的作用，单独使用Na2S提供硫环境时，并没有得到比较好的试验结果，因此将试验改为以Na2S和Na2S2O3的混合物来提供硫环境。

Na2S和Na2S2O3的添加的方法为在对培养基进行排氧的同时缓慢添加Na2S，直到培养基的颜色变为无色后，培养基所必需的剩余的硫元素再由Na2S2O3提供，按照硫含量的比例得出Na2S ∶Na2S2O3为1 ∶2。

如图3所示，在以Na2S和Na2S2O3的混合物为硫源后，虽然在发酵前的5 h仍然有大量的H2S溢出，发酵液的pH值也有所升高，但由于此次利用的硫源为Na2S和Na2S2O3的混合物，细菌表现出仍然可以正常生长并产气，因此在发酵进行5 h后，产气速率又开始缓慢上升，发酵15 h左右产气速率开始逐渐趋向稳定，一直到33 h左右产气速率仍一直维持在 90 mL/（L·h） 左右。

此次发酵共产生了3 253 mL的气体，经测定，氢气的含量在40%左右，由此发酵共产生了58 mmol H2；得到的氢气的转化率达到了7.73 mmol/g VS，与Carver等试验中利用的高温厌氧产氢菌的转化率相当[15]，达到了较高的转化率，从而表明高温厌氧菌Cal. changbaicum具有广阔的应用前景。可见，在利用Na2S和Na2S2O3混合物作为硫源时，既可以快速排除培养基中的氧气，减小培养基中的痕氧对细菌生长产生的不利影响，同时还可以保证培养基中有效的硫环境，实现高温厌氧产氢菌的正常生长和产氢。

3结论

试验结果表明，在高温厌氧菌Cal. changbaicum的生长环境中没有硫元素的存在时，细菌无法正常生长，说明硫元素是此类细菌的生长过程中的必需元素之一。高温厌氧菌对硫源存在着一定的选择性，通过厌氧瓶培养得到生长和产氢的最佳硫源为Na2S和Na2S2O3 2种化合物。当以Na2S和Na2S2O3混合物作为硫源在生物反应器中发酵时，氢气的转化效率高达7.73 mmol/g VS，这说明混合的硫源对高温厌氧产氢菌发酵纤维素产氢具有明显影响，从而为该菌的进一步利用提供了良好的理论和技术依据。

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