罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株遗传背景的RAPD分析

摘要：为了给无籽罗汉果优良品种的选育提供分子生物学依据，利用RAPD标记对28份罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株进行遗传背景分析。结果表明，罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景存在一定的丰富性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近。总的来说，罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株遗传背景的复杂性较低，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，丰富无籽罗汉果亲本的遗传背景。

关键词：罗汉果；二倍体；三倍体；遗传背景；RAPD

中图分类号： S567.903文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0241-03

收稿日期：2014-04-15

基金项目：国家科技支撑计划 （编号：2011BAI01B03）；国家自然科学基金 （编号：81373914）；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）

作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，博士，助理研究员，主要从事生药学研究。E-mail：wrc830612@163.com。罗汉果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属多年生藤本植物[1]，为我国南方特有的珍贵药用植物和甜料植物，主产于广西壮自治区永福、临桂、龙胜、兴安和融安等地[2]。罗汉果果实含多种甜苷，其中甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300～400倍，是一种综合性状极佳的天然甜味剂，广泛应用于食品、药品和保健品中，适合所有人群长期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血压患者的理想糖替代品[3-4]。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果实等部位的生物量和产量，其中三倍体罗汉果还具有无籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个罗汉果产业具有里程碑的意义[5]。罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结的果实即为无籽罗汉果。本研究利用RAPD分子标记技术[6-9]探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到28份材料：二倍体雄株7份，三倍体雌株21份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交获得（表1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，采集约10张健康成熟的叶片并混合成该份材料的样品，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。

1.2RAPD分析

采用改良CTAB（2×）法[10]提取罗汉果叶片的总DNA。

引物筛选：从材料中随机选出6份样品（包含2x、4x）进行引物筛选，从200条RAPD引物中筛选出20条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。20个RAPD引物名称、序列见表2。

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：将扩增产物置于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不超过5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作为标准分子量对照，经溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察拍照、记录。

RAPD为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位置上有扩增条带记录为1，无扩增条带记录为0，构建0-1原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的并且长度在400～2 000 bp范围内的ISSR扩增条带才被记录。用AFLP-SURV version 1.0[12]计算材料间遗传距离D，按D=-lnⅠ计算Nei & Li遗传相似性系数；用NTSYS-pc version 2.02[13]软件的UPGMA（unweighted pair group method using arithmatic average）方法进行聚类分析；用GenAIEx version 6.3[14]进行主坐标分析。

2结果与分析

2.1多态性分析

用20个RAPD引物对28份材料的总DNA进行PCR扩增，重复2次，2次扩增产物重复性好且稳定，扩增得到的总条带数及多态性条带数见表2。20个引物扩增条带数的范围为 6～17条，共同带在1～8条内，多态性条带数范围为3～13条，多态性百分比为25.00%～88.89%，且由总计的结果可知，扩增总条带数为239条（平均每个引物11.95条），其中最多，为17条；引物S170得到的条带最少，为6条。其中，引物S411的扩增图谱见图1。此外，在不同罗汉果品种间存在的多态性条带可作为鉴定品种的特征带。

2.2遗传相似性系数及遗传距离

28份材料间的相似性系数变化范围为0.691 0～0.920 6，其中F302与M202间的相似性系数最低（0.691 0），遗传距离最高（0.369 6）；而F305与F306间的相似性系数最高（0.920 6），遗传距离最小（0.082 7）。

2.3聚类分析

从图2可看出，F305和F306直接聚为一类，具有很高的相似性系数，两者距离最近；F321独成一支，与其余材料相距较远；基本上相似性系数较高的材料排列并聚为一类。

2.4双变量主坐标分析

主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于Nei & Li遗传距离及相应的相似性系数进行的。因此，主坐标分析图中各个个体（品种）间的位置关系反映了它们在遗传上的相似性。由于每份试验材料都是通过选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，共采集约10张健康成熟叶片混合而成的，因此这28份材料的主坐标分析可看作“双变量主坐标分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：一种将物种与物种之间差异考虑到群体间相互关系的测度之中的排序方法）[15-16]。通过RAPD标记对28份材料进行DPCoA排序发现，前3个主坐标的方差贡献率分别为26.81%、21.86%endprint

和17.60%，相对应的累积贡献率分别为26.81%、48.67%和66.27%。一般认为，如果前3个主要特征向量的方差占总方差的40%以上，则排序效果是满意的[17]，本试验结果 28 份材料的前3个主要特征向量的方差累积贡献率高达6627%，说明降维效果较好。因此，保留DPCoA的前二轴对28份材料进行排序分析，应用GenAIEx version 6.3获取坐标轴特征值及样品特征向量，并据此划分出28份不同材料在DPCoA前二轴空间中的排序图见图3。

由Proj划分而得的28份材料在PCoA排序图中空间分布十分明显，除F316和F318有部分交叉重叠外，其余样品间均无交叉重叠现象。PCoA排序图把28份材料分为三大类。第一大类位于A区间，其中三倍体雌株4份（F312、F313、F320、F321），二倍体雄株2份（M201、M204）。第二大类位于B和第D区间，其中只包括三倍体雌株12份（F301、F302、F303、F304、F305、F306、F307、F308、F309、F310、F311、F314）。第三大类位于C区间，其中只包括三倍体雄株3份（F316、F318、F319）、二倍体雄株5份（M202、M203 、M205、M206 M207）。

比较图2和图3可知，对28份材料所进行的亲缘关系聚类分析和双变量主坐标分析的结果基本上是一致的，雌株和雄株间的距离相对较近聚在一起，而双变量主坐标分析能从多个方向、多个层面更直观和准确地反映材料间的遗传关系。

3结论与讨论

3.1罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的RAPD相关遗传

根据RAPD分析结果可知，有的材料之间虽然是不同的种质，但遗传相似性系数较高，说明它们的亲缘关系近；如F315因为由Nongyuan B6与M204株系杂交而成，所以与M204关系较近，其相似性系数高达0.816 3。此外，在三倍体雌株中，如果其亲本相同或相似性系数较高，由于子代继承了亲本一定的遗传物质，因而子代间的相似性系数也会较高，如F318和F319，由于其母本都是Yongqing 1，因此其相似性系数高达0.912 3；而因为F305和F310也都为同一父本M205，所以其相似性系数也高达0.858 0。

3.2罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的合理组配

F302与M202间的相似性系数仅为0.6910，还有M201与F302、F309及F312与M207间的相似性系数都仅为0.716 1，遗传距离较大；而且M202与母本间的相似性系数均在 0.6～0.7 之间。因此，初步推测罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株中最适合作雌雄组配的是F302与M202，其次是F302与M204、F309与M204、F312与M207。

值得指出的是，虽然罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景存在一定的复杂性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，丰富三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育奠定坚实基础。endprint