柴芍胃炎颗粒对胃溃疡大鼠黏膜细胞因子的影响

李　兵，肖国辉，冯　雯，王天刚，曾　俊，向　未，杨伟兴（.四川医科大学03级研究生，四川　泸州　646000；.四川医科大学附属中医院脾胃病科，四川　泸州　646000）

柴芍胃炎颗粒对胃溃疡大鼠黏膜细胞因子的影响

李兵1，肖国辉2，冯雯1，王天刚2，曾俊2，向未2，杨伟兴2
（1.四川医科大学2013级研究生，四川泸州646000；2.四川医科大学附属中医院脾胃病科，四川泸州646000）

［摘要］目的：研究柴芍胃炎颗粒对胃溃疡愈合的影响，并探讨其机制。方法：40只wistar大鼠，随机分为正常组、模型组、奥美拉唑组、柴芍胃炎颗粒组（简称胃炎颗粒组），采用改良Takagi法制作乙酸胃溃疡大鼠模型，治疗13天后测量各组溃疡指数，用免疫组化法检测胃黏膜细胞Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性密度。结果：柴芍胃炎颗粒组与其他组比较溃疡指数明显降低（P＜0.01），柴芍胃炎颗粒组与奥美拉唑组Bcl-2的表达明显高于模型组（P＜0.01），且柴芍胃炎颗粒组高于奥美拉唑组（P＜0.01）。柴芍胃炎颗粒组NF-κB的表达明显低于模型组（P＜0.01）。结论：柴芍胃炎颗粒能通过提高Bcl-2抑制细胞凋亡、降低NF-κB蛋白的表达促进溃疡愈合，并可能是其促进溃疡愈合机制之一。

［关键词］柴芍胃炎颗粒；胃溃疡；BCl-2；NF-κB；实验研究

［Abstract］Objective：To study the protective effect of Chaishao Weiyan Granules on gastric ulcer of rats and its effective mechanism. Method：40 healthy wistar rats were randomly divided into model group，Chaishao Weiyan Granules group，omeprazole treatment group and normal group. The rat model of gastric ulcer was made by Takagi’s method with some modification. After the rats were treated for 13 d，the index of each group of ulcer and the expression of Bcl-2 and NF-κB in the gastric ulcer tissues was examined by immunohistochemical method. Result：Chaishao Weiyan Granules group could obviously decrease the ulcer index more than the others group（P＜0.01）. Compared with that of the model group，the expression of Bcl-2 in Chaishao Weiyan Granules group and omeprazole group was significantly higher（P＜0.01）and that of Chaishao Weiyan Granules group was higher than that of omeprazole group（P＜0.01）.The expression of NF-κB Chaishao Weiyan Granules group was significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Chaishao Weiyan Granules could increase Bcl-2 to inhibit apoptosis and reduce the expression of NF-κB protein to promote ulcer healing，which may be one of the mechanisms to promote ulcer healing.

［Key Words］Chaishao Weiyan Granules；Gastric ulcer；Bcl-2；NF-κb；Experimental study

消化性溃疡（peptic ulcer，PU）是常见的消化系统疾病，人群中患病率高达5%～10%［1］，且95%的消化性溃疡发生在胃和十二指肠。中医药治疗消化性溃疡具有多靶点、多途径的［2］独特优势。本文采用免疫组化的方法，观察柴芍胃炎颗粒治疗大鼠实验性胃溃疡的效果，及其对胃黏膜细胞Bcl-2、NF-κB表达的影响，探讨其治疗胃溃疡的作用机制。

1　实验材料

动物：清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量（190±40）g，由四川医科大学实验动物中心提供。动物合格证号为SYXK（川）2013-065。

药物：柴芍胃炎颗粒。药物组成为柴胡、白芍、黄连、吴茱萸、丹参、延胡索、枳壳等。采用中药免煎颗粒，每袋10g，由四川医科大学附属中医院制剂室提供（生产批号：川药制字Z20080300），奥美拉唑胶囊（悦康药业集团有限公司生产，生产批号14340346）。

仪器与试剂：荧光正置显微镜（日本Nikon80i），戊巴比妥钠粉剂（武汉博士德有限公司），GTVISION TMⅠ型免疫组化检测试剂盒（基因科技上海有限公司），NF-κB、Bcl-2免疫组织化学染色抗体试剂盒（abcam艾博抗上海贸易有限公司）。以上试剂均按照试剂盒说明书制备和使用。

2　实验方法

分组及模型制备：将40只wistar大鼠随机分为4组，分别是正常对照组、病理模型组、胃炎颗粒组、奥美拉唑组，每组各10只，除正常对照组外，余3组按照Takagi［3］方法改良造模，造模前大鼠禁食24h，不禁水，用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定于解剖板上，腹壁剑突下剪毛，常规消毒铺巾，从剑突下纵向剪开腹壁约3cm，沿腹白线剪开腹壁，打开腹腔，可见腹部器官，以无齿镊沿肝脏后找出胃，0.25mL注射器在胃窦前壁近小弯侧注入0.03mL100%乙酸，达胃壁肌层与浆膜层之间（进针约0.4～0.5mm）［4］。2mL青霉素腹腔冲洗，以缝合线将腹膜、腹壁各层组织间断缝合，再间断缝合皮肤。

动物分组及喂药：造模后第3天开始给药，奥美拉唑组予奥美拉唑溶液，浓度为0.4mg/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；胃炎颗粒组给予1.25g/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；正常对照组、模型组灌喂生理盐水，按1mL/100g灌胃，日1次。

标本采集及处理：灌胃13天后停药，各组大鼠禁食24h，颈椎脱臼法处死；剪开大鼠腹腔，分别结扎幽门、贲门端后取出胃，沿胃大弯剪开，冰生理盐水冲洗，以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材，迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24h。按照常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋5µm厚度，以瘢痕的最长径为中心连续切片。

检测指标及方法：根据文献报道方法，用分规测量溃疡体积，溃疡长度为溃疡的最大直径，宽度为与直径垂直的最宽距离［5］。溃疡面积=长×宽，深度按大于或小于2mm计算。溃疡体积仿Okabe法［6］，用溃疡指数（ulcer index，UI）表示，分10级。见表1。

表1　大鼠溃疡指数计算方法

免疫组化染色法：操作方法按照试剂盒说明书。其检测结果判定棕黄色颗粒为细胞浆或细胞核阳性表达。染色后运用计算机图像分析仪（Motic images软件系统）进行图像半定量分析测定，每组随机抽取5只大鼠切片各1张，每张随机选取5个视野进行积分光密度值（integrated o ptical dens ity，IOD）测量。

统计学处理：用SPSS22.0统计软件进行方差分析，数据以均数±标准差（±s ）表示。多组均数比较采用ANOVA检验，组间比较采用非配对t检查，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　实验结果

3组溃疡指数测定结果比较见表2。

表2　3组溃疡指数测定结果比较 （mm2，±s）

表2　3组溃疡指数测定结果比较 （mm2，±s）

组 别　n 　　溃疡指数模型组　10　17.31±0.59奥美拉唑组　10　8.95±0.35△胃炎颗粒组　10　6.49±0.18△*

注：与模型组比较，△P＜0.01；与奥美拉唑组比较，*P＜0.01。

形态学观察免疫组化染色显示，在正常对照组大鼠胃黏膜上皮细胞中，可见Bcl-2蛋白表达较强，主要集中在腺管内，并且表达颗粒较粗；而在胃炎颗粒组中，Bcl-2蛋白阳性表达主要集中在胃黏膜底部，黏膜表层较弱。各组大鼠胃黏膜上皮细胞Bcl-2蛋白的阳性密度结果比较见表3。

表3　各组大鼠黏膜上皮细胞Bcl-2蛋白的阳性密度结果比较（%，±s）

表3　各组大鼠黏膜上皮细胞Bcl-2蛋白的阳性密度结果比较（%，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.01；与奥美拉唑组比较，*P＜0.01。

组 别　n 　　阳性密度正常组　10　24.20±0.34模型组　10　12.17±0.56奥美拉唑组　10　14.57±0.32胃炎颗粒组　10　22.01±0.36△*

形态学观察正常组大鼠，胃黏膜细胞胞浆中有NF-κB蛋白表达，胞核未见明显表达。造模13d，模型组随着溃疡的愈合，再生黏膜胞浆、胞核均有表达，此时NF-κB蛋白具有失活和活化两种状态；而胃炎颗粒组和奥美拉唑两组中，核染色均不及模型组，染色部位主要以胃黏膜腺上皮细胞胞浆为主。

各组大鼠胃黏膜NF-κB蛋白的阳性密度结果比较见表4。

表4　各组大鼠黏膜上皮细胞NF-κB蛋白阳性密度结果比较 （%，±s）

表4　各组大鼠黏膜上皮细胞NF-κB蛋白阳性密度结果比较 （%，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.01。

组 别　n 　　阳性密度正常组　10　 0.33±0.40模型组　10　 5.40±0.07奥美拉唑组　10　 2.95±0.09△胃炎颗粒组　10　 2.80±0.04△

4　讨　论

Bcl-2与凋亡密切相关，是目前研究较为透彻的一个基因家族。Bcl-2家族的成员通常以二聚体的形式发挥作用。在控制细胞生存和死亡中起重要作用［7］。很多研究发现细胞凋亡在溃疡修复过程中也起着重要的调控作用［8］。细胞凋亡是涉及基因调控的复杂过程，其中Bcl-2可能是调控胃溃疡胃黏膜上皮细胞凋亡的主要基因［9］。本实验研究表明，溃疡模型组中的Bcl-2基因蛋白表达明显低于正常组，而柴芍胃炎颗粒组Bcl-2蛋白表达明显增加。在溃疡修复后，Bcl-2蛋白基本可恢复至正常水平表达。说明柴芍胃炎颗粒治愈胃溃疡的机制与减少胃黏膜细胞的凋亡，增加抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达有关。

NF-κB是参与炎症反应的一个重要转录因子，在生理状态下，它与κB抑制蛋白（IκB）结合以非活性状态存在于细胞质中，当其受内毒素、氧自由基、细胞因子等的刺激后被激活，导致IκB磷酸化降解，NF-κB 与IκB解离，快速从细胞质移位进入细胞核内，通过自身核定位序列与相应的靶序列结合，调控相应的靶基因表达，调控多种炎症因子转录进而调节炎症进程，如调控黏附分子、前炎症介质、趋化因子和一些炎性相关酶类的过度或持续表达，而使大量的炎性细胞积聚浸润于炎症部位，导致持续或放大的炎症反应［10］。有研究表明，消化性溃疡其胃黏膜上皮细胞NF-κB的活性是明显增加的，且NF-κB阳性细胞数与炎症程度呈明显相关［11］。本实验结果显示，正常组大鼠胃黏膜有极少NF-κB阳性表达，乙酸诱导胃溃疡后，胃黏膜NF-κB激活，引发胃黏膜炎症反应，参与溃疡发生，NF-κB活化表达与溃疡指数呈正相关，提示其可能是影响溃疡发生的关键因素之一。胃炎颗粒组和奥美拉唑组NF-κB表达明显低于模型组，胃炎颗粒组溃疡指数均显示减低，说明柴芍胃炎颗粒可通过抑制NF-κB激活和表达，减轻过度炎症反应，促进溃疡愈合。

柴芍胃炎颗粒是我科已故四川名老中医周德端教授的经验方。方中柴胡具有解热，抗炎，促进免疫功能；芍药能抑制Hp，从而减轻炎症，促进病变组织修复；黄连的主要成分为小蘖碱，抗菌谱广，对Hp抑菌力较强，并能抗乙酰胆碱，有解痉镇痛作用；丹参活血化瘀，通络止痛，用丹参活血化瘀能增加黏膜组织的循环灌注促进其能量代谢，保证黏膜上皮及溃疡底部和边缘腺体迅速再生及保持黏膜微循环的酸碱平衡等，从而提高溃疡愈合质量［12］。

本研究表明，柴芍胃炎颗粒对大鼠实验性胃溃疡疗效显著，通过提高胃黏膜组织中Bcl-2阳性表达以减少细胞凋亡，降低胃黏膜组织中NF-κB阳性表达，从而抑制炎症反应，最终达到修复溃疡的目的，可能是其促进溃疡愈合的重要机制之一。

［参考文献］

［1］杨子敬.消化性溃疡的研究进展［J］.内科，2009，4（6）：925-927.

［2］沈鹰.健脾方药对胃黏膜保护作用的研究及其意义［J］.世界华人消化杂志，1999，7（4）：357-358.

［3］Takagi K，Okabe S，Saziki R.A new method for the production of chronic gastric ulcer in rats and the effect of several drugs on its healing［J］.Jpn J Pharmacol，1969，19：418-426.

［4］林寿宁，黄贵华，韦维，等.安胃汤免煎剂对实验性胃溃疡大鼠血清胃泌素、表皮生长因子的影响［J］.广西中医药，2005，28（5）：46-49.

［5］黄国栋，李家邦，黄媛华，等.健胃愈疡颗粒干预下大鼠胃溃疡黏膜乳癌相关肽和血小板活化因子的表达及与胃黏膜疏水性的相关性研究［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（21）：4169-4173.

［6］Okabe S，Roth JLA，Pfeiffer CT.A method for experinmental，penetrating gastricand duodenal ulcers in rats［J］.Am J Dig Dis，1971，16（3）：277-284.

［7］Szabo I.Tarnawski AS.Apoptosis in the gastric mucosa：molecular mechanism，basic and clinical implication［J］.J Physiol Pharmacol，2000，52：3-15.

［8］Que FG，Gores GJ.Cell death by apoptosis：basic concepts and disease relevance for the gastroenterologist ［J］.Gastroenterology，1996，110：1238-1243.

［9］Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolong，Bax，that accelerates programmed cell death［J］. Cell，1993，74：609-621.

［10］Chen FE，Huang DB，Chen YQ，et al.Crystal structure of p50 /65 heterodimer of transcription factor NF-κB bound to DNA［J］.Nature，1998，391（22）：410-413.

［11］Van DB，Ten FJ，Ponsioen CY，et al.Expression and activation of NF-κB in the antrum of the human stomach［J］.J Immunol，2000，164：3353.

［12］黄适，林寿宁，朱永萍，等.中西医结合治疗胃溃疡临床观察［J］.辽宁中医杂志，2003，30 （11）：928-929.

［收稿日期］2015-07-27

［通讯作者］杨伟兴

［基金项目］泸医院科（2013）60号泸州医学院-泸州医学院附属中医院联合基金课题

［中图分类号］R256.337.31

［文献标识码］B

［文章编号］1004-2814（2015）12-1086-03