香格里拉地区山脉土壤微生物分布及药敏结果

子建文，资云海，唐 辉，李 倩，张胜梅，李晓霞

高原地区土壤微生物分布已有报道，但云南高海拔地区土壤微生物调查报道较少，本研究对香格里拉地区远离农户、人群、农牧场的山脉土壤微生物的分布和药敏情况进行了调查，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样地选择 2014 年11 月中旬于香格里拉，样地均为由稀疏灌木丛覆盖的山坡地，且远离农户、人群、牧场10 km 以上，在香格里拉县城的东南西北方向20 km 以外分别设置具有代表性的1、2、3 和4 号采样点，经纬度分别是99°10′27″E27°29′18″N、99°24′31″E27°36′25″N、99°31′16″E27°32′9″N 和99°42′4″E27°49′2″N，海拔分别为3312、3185、3489 和3289 m，每个点分为阳坡和阴坡。

1.2 标本采集 按随机布点法[1]，在每个采样点的阳坡和其对应的阴坡分别以“Z”字型选取4 个点，除去地面植被和枯枝落叶，铲除1 cm 左右的表土，挖好剖面后，烧灼法消毒取样铲，取深度为30 cm 的黄土，需氧标本放于无菌均质袋中，厌氧标本放入无菌厌氧袋内，标记后密封运送。 无菌均质袋由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 培养与鉴定

1.3.1 需氧菌与真菌 称取10 g 新鲜土壤，加入盛100 ml无菌水的500 ml 三角瓶内，振荡10 min，使土壤均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液，吸取1 ml 土悬液到9 ml 无菌水中，按10 倍法依次稀释，真菌稀释105倍，细菌稀释106倍。 取稀释好的菌液倾注3 块血平板(1 ml/块)，置于37 ℃温箱孵育48 h；真菌倾注3 块沙氏培养基(1 ml/块)，置于25 ℃温箱孵育72 h，然后计数菌落，计算出土壤中微生物数量。 观察平板上的菌落形态、颜色。 对生长的细菌进行革兰染色，用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD 全自动微生物鉴定仪（赛默飞世尔科技公司）进行细菌鉴定。 真菌鉴定根据肉眼观察在沙氏培养基上生长形态及显微镜观察真菌孢子形态。将性状相同的菌类进行归类。药敏试验采用美国临床试验室标准化研究所（CLSI）推荐的K-B 法，药敏纸片由贝瑞特生物技术有限责任公司生产提供。

1.3.2 厌氧菌 将标本接种于9.0 cm 直径的厌氧培养基中，置于35 ℃厌氧培养箱中培养48 h。采用法国梅里埃公司生产的VITEK 2 系统及其配套的测试卡进行鉴定和药敏试验。

1.4 质控菌株 大肠埃希菌ATCC-25922、 铜绿假单胞菌ATCC-27853、金黄色葡萄球菌ATCC-25923，购自云南省临床检验中心。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0 软件包分析数据，WHonet 5 软件包对药敏资料进行分析。 不同采样点的阴坡或阳坡微生物数量之间比较用方差分析，同一采样点的阳坡和阴坡之间比较用独立样本t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各采样点微生物分布 4 个采样点阳坡的细菌总数和真菌总数之间的差异无统计学意义（P ＞0.05），阴坡之间的差异亦无统计学意义（P ＞0.05），但4 个采样点的阳坡与阴坡的微生物总数均存在统计学差异（P ＜0.05），即细菌（或真菌）总数阴坡＞阳坡（见图1、2）。

2.2 各采样点微生物构成 各种细菌或真菌在不同采样点的构成比无统计学差异（P ＞0.05）；各采样点的厌氧菌构成比无统计学差异（P ＞0.05），但革兰阴性菌、革兰阳性菌及真菌构成比有统计学差异（P ＜0.05），革兰阴性菌＞革兰阳性菌＞厌氧菌＞真菌（表1）。

图1 各采样点阴阳面土壤中细菌数均值

图2 各采样点阴阳面土壤中真菌数均值

表1 香格里拉不同采样点土壤中微生物构成[株(%)]

表2 香格里拉土壤中革兰阴性菌对常用抗生素药物的敏感率[株（%）]

表3 香格里拉土壤中革兰阳性菌对常用抗生素药物的敏感率[株(%)]

表4 香格里拉土壤中厌氧菌对常用抗生素药物的敏感率[株(%)]

表5 香格里拉土壤中真菌对药物的敏感率[株(%)]

2.3 革兰阴性菌药敏试验 氨基糖苷类和半合成青霉素类抗生素敏感率较高，除嗜水气单孢菌对阿米卡星敏感率为85.7%外，其余均为100.0%；喹诺酮类中，左氧氟沙星对所鉴定的细菌全敏感， 其余细菌敏感性在75.3%～100.0%之间。头孢菌素中，革兰阴性菌对头孢哌酮/舒巴坦敏感率100.0%；其次是头孢噻吩和头孢唑啉，敏感率大于85.7%； 除铜绿假单胞菌和栖稻黄色单胞菌敏感率介于76.5%～82.9%外，其余细菌对头孢曲松和头孢呋辛钠敏感率均为100.0%； 而铜绿假单胞菌和栖稻黄色单胞菌对头孢西丁敏感率100.0%， 其余细菌敏感率介于52.4%～56.5%之间。 革兰阴性菌对碳青霉烯类敏感率51.8%～100.0%。 栖稻黄色单胞菌和嗜水气单孢菌对复方新诺明敏感率100.0%，其余细菌敏感率介于75.9%～96%之间。嗜水气单胞菌、 豚鼠气单胞菌和河流弧菌对氨曲南敏感性100.0%，其余细菌介于50.6%～57.3%之间。 见表2。

2.4 革兰阳性菌药敏试验 所分离得到的革兰阳性菌对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、米诺环素、妥布霉素、阿米卡星和万古霉素普遍敏感，敏感率在97.4%以上；腐生葡萄球菌对所有抗生素敏感，未发现耐药株。 见表3。

2.5 厌氧菌药敏试验 分离出的4 种厌氧菌对常用抗生素的敏感率在90.9%以上。 除坏名梭菌对氯霉素和青霉素敏感率为90.9%外，其余敏感率均为100.0%。 见表4。

2.6 真菌药敏试验 合成类抗生素、伏立康唑及伊曲康唑对4 种真菌全覆盖， 敏感率均为100.0%。 真菌对克霉唑、特比萘芬的敏感率在90.0%以上。 见表5。

3 讨论

高海拔地区具有独特的自然地理环境，其主要特征是高寒、缺氧、日照时间长，辐射强，降水较少，相对干燥[2]。该区域山脉阴阳坡面在日照辐射、相对温湿度等方面差异显著，造成区域内微生物数量分布差异[3-5]。本试验结果表明，香格里拉高海拔山脉阴坡面土壤中微生物数量大于阳坡。香格里拉高海拔山坡地域因其独特的高原自然地理环境和人文环境，土壤污染小，土壤微生物数量明显低于其他低海拔地区。

该区域4 个采样点土壤微生物数量及构成比之间无显著差异， 各点土壤中微生物以细菌为主， 平均占96.54%，真菌数量较少，平均占3.46%。细菌中革兰阴性菌数量多于革兰阳性菌；革兰阴性菌中优势菌为痢疾志贺菌（8.54%）、 栖稻黄色单胞菌 （8.16%）、 铜绿假单胞菌（7.87%）和侵肺巴斯德菌（7.97%），革兰阳性菌中优势菌为腐生葡萄球菌（14.59%）、蜡样芽胞杆菌（14.59%）和苏云金芽孢杆菌（8.54%）。

该区域土壤中微生物药敏试验结果表明，香格里拉高海拔山脉坡面土壤中细菌、 真菌对绝大多数抗生素敏感，高海拔山地环境中土壤微生物对常用抗生素的敏感性较低海拔地区高，其中厌氧菌仅检出1 株耐氯霉素的坏名梭菌，其余菌株敏感率均为100%；但是也检出对头孢菌素、氨曲南及红霉素等耐药的菌株，说明长期广泛使用此类抗生素，即使在远离农户、人群、牧场的高海拔区域，也已有耐药菌株的存在。

高海拔地区自然灾害和事故也时有发生，人员受伤不可避免，尤其是火器伤伤口创面可不同程度被空气和土壤中的细菌污染，创面感染细菌的种类与受伤部位周边存在的菌群有密切关系[6]，且感染以条件致病菌和耐药菌株为多[7]。相关动物模型试验表明，伤口早期感染细菌与所处环境细菌谱有交叉重叠[8]。 摸清此类地域土壤微生物本底状况，为创伤感染细菌检测和治疗提供依据具有现实意义。

[1] 林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M].北京：高等教育出版社, 2010：29-38.

[2] 王根春,李主一,安梅,等.西藏高原空气、河水中细菌学调查报告[J].中国卫生检验杂志,1998,8(4)：226.

[3] 李晓玲,葛迪,高婷,等.某城市城区空气细菌、真菌分布研究[J].西北国防医学杂志,2013,34(6)：550.

[4] 方治国,欧阳志云,赵景柱,等.乌鲁木齐城市空气细菌群落结构与动态变化特征[J].微生物报,2006,46(4)：618.

[5] 张晟,郑坚,付永川,等.重庆市城市空气微生物污染及评价[J].环境与健康杂志,2002,19(3)：231.

[6] 姚咏明,盛志勇.脓毒症防治学[M].北京：科学技术文献出版社,2008：18-21.

[7] 王建,葛宝丰,刘兴炎,等.猪肢体软组织爆炸伤创面感染细菌谱及药敏分析[J]. 解放军预防医学杂志,2008, 26(2)：118.

[8] 郭业彬,舒为群.军事作业环境微生物与战(创)伤感染[J].解放军预防医学杂志,2011,29(4)：306.