氯喹在诱导肝癌细胞死亡中的作用机制研究

丁振斌　史颖弘　彭远飞　宋康　周俭　樊嘉

(复旦大学附属中山医院肝外科，上海　200032)



氯喹在诱导肝癌细胞死亡中的作用机制研究

丁振斌史颖弘彭远飞宋康周俭樊嘉

(复旦大学附属中山医院肝外科，上海200032)

摘要目的：研究自噬抑制药物氯喹(chloroquine，CQ)诱导肝癌细胞死亡的作用机制，探索自噬相关药物可能的临床应用价值。方法：选取3种肝癌细胞系，给予不同浓度CQ干预24 h，采用MTT法检测细胞的增殖情况，采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞死亡，采用Hochest33342染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色、Western blotting (caspase-9)法检测凋亡。采用GFP-LC3转染、Western blotting (LC3)及细胞电镜技术检测细胞自噬功能。结果：MTT检测显示，CQ作用24 h能够显著抑制肝癌细胞增殖。CQ(≥20 μmol/L)干预后，PI染色阳性细胞明显增多，Hochest33342核染色显示核浓聚、核碎裂，TUNEL 染色阳性细胞明显增多，caspase-9活化；而CQ(5、10 μmol/L)干预后PI染色阳性细胞数目无明显变化。CQ处理细胞后，GFP-LC3阳性细胞明显增多，LC3-Ⅱ蛋白表达明显增高。同时用caspase抑制剂Z-VAD-FMK和3-MA或沉默Atg5的表达预处理，可显著抑制40 μmol/L CQ诱导的MHCC97-L细胞的死亡。结论：CQ可以抑制肝癌细胞自噬降解，导致自噬小泡及自噬标志性蛋白积聚。大剂量CQ直接诱导肝癌细胞死亡，其死亡形式既具有凋亡的特征又具有自噬样死亡的特征。

关键词自噬；肝细胞肝癌；凋亡；氯喹

自噬作用是细胞在饥饿、能量缺乏等代谢压力下的一种生理过程。细胞内的蛋白、细胞器和胞质通过自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸，循环利用，合成新的大分子和ATP，以维持细胞的正常代谢和生存[1]。同时，自噬作用在某些情况下可以选择性地清除某些细胞成分，如清除受损或多余的过氧化物酶体、内质网、线粒体、DNA，以此减少异常蛋白、细胞器的堆积，维持细胞自我稳态[2]。自噬作用虽具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用，但如过度，自噬作用也可以引起细胞死亡，即“自噬性细胞死亡”，也称为Ⅱ型程序化细胞死亡[3]。自噬作用在机体的生理和病理过程中都有其踪迹，与人类的多种疾病，尤其是恶性肿瘤存在密切关系。

近年来研究[4]发现，氯喹(chloroquine，CQ)可以有效地抑制自噬降解作用，增强p53诱导凋亡的效果。而另一项研究[5]则发现，CQ小剂量时通过抑制自噬降解作用直接诱导肿瘤细胞凋亡，而大剂量时促使自噬样死亡。因此，我们推测肿瘤自噬降解是一把双刃剑。为了验证我们提出的假设，探索自噬相关药物CQ在肝癌治疗中的应用价值，我们对不同的肝癌细胞系进行了体外的CQ干预实验。

1资料与方法

1.1一般资料人肝癌细胞系MHCC97-L为复旦大学肝癌研究所建立，人肝癌细胞系Hep3B、HepG2由美国康奈尔大学惠赠。兔抗人LC3抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品。小鼠抗人GAPDH抗体为上海康成生物工程有限公司产品。HRP 标记的羊抗小鼠和羊抗兔IgG 抗体购自河南华美生物工程公司。转染试剂Lipofectamine 2000 及Opti-MEM为Invitrogen公司产品。CQ、3-MA、凋亡诱导剂星形孢菌素和广谱的凋亡抑制剂Z-VAD-FMK购自美国sigma公司。siRNA由上海吉玛技术公司设计合成。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒购自上海碧云天技术公司。

1.2方法

1.2.1四甲基偶氮唑盐法(MTT)以每孔5×103个细胞的密度将细胞接种于96 孔细胞培养板内(100 μL/孔)，置于细胞培养箱内培养。进行CQ干预后弃去原培养液，每孔细胞加入新鲜培养基200 μL及MTT 液10 μL，温育4 h后吸去培养液，加入DMSO 100 μL，避光摇晃15 min，用酶标仪于490 nm波长处测量。同时设置空白孔、对照孔。每组设定6复孔。

1.2.2PI染色法检测细胞死亡加入适当量PI染色液，须充分覆盖待染色的细胞，轻轻混匀，冰浴避光放置后直接在荧光显微镜下观察。细胞发生死亡时，PI能穿透细胞膜，发出红色荧光。每个孔计算10个高倍视野(×200)，每组设6复孔。

1.2.3TUNEL染色检测凋亡用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次。在样品中加50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次后用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察。

1.2.4Hoechst 33342染色检测凋亡加入适量Hoechst 33342染色液，须充分覆盖待染色的细胞，37℃培养20 min。弃染色液，用PBS洗涤1次后直接在荧光显微镜下观察。

1.2.5统计学处理采用SPSS 15.0 软件进行统计分析。对各组数据首先进行正态性检验，两组计量资料间比较采用独立t检验，多组间比较采用χ2分析。P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度CQ对肝癌细胞的抑制作用MTT检测显示，用CQ处理24 h能够显著抑制肝癌细胞(MHCC97-L、HepG2、Hep3B)的增殖，而且具有浓度依赖性(图1)。PI染色结果显示，大剂量CQ(≥20 μmol/L)干预细胞24 h后，能显著诱导肝癌细胞死亡，PI染色阳性细胞明显增多并随浓度增加而增多(P<0.05)，见图2；而小剂量CQ(5、10 μmol/L)干预24 h无法诱导肝癌细胞死亡(P>0.05)，见图2。

*P<0.05,**P<0.001)

图1MTT法检测CQ作用24 h后MHCC97-L、Hep3B及HepG2的增殖情况

2.2大剂量CQ诱导的肝癌MHCC97-L细胞死亡既具有凋亡的特征又具有自噬样死亡的特征40、80 μmol/L CQ作用MHCC97-L细胞24 h后，Hochest33342核染色显示有核浓聚、核碎裂；TUNEL染色阳性细胞明显增多(图3)；caspase-9的Western blotting显示35、37 kD处可见到分裂体，提示caspase-9活化、细胞凋亡明显，见图3。应用广谱的凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(50 μmol/L)预处理细胞可以显著抑制星形孢菌素诱导的细胞凋亡，但无法抑制40 μmol/L CQ诱导的细胞死亡(图4)；这提示，大剂量CQ除了诱导凋亡以外可能促进其他形式的细胞死亡。

*P<0.05,**P<0.001

图2PI染色检测CQ作用24 h后MHCC97-L、Hep3B

及HepG2细胞的死亡情况

因此，我们用电镜对大剂量CQ(40 μmol/L)处理后的MHCC97-L细胞的超微结构进行了观察，发现不仅有大量凋亡小体，而且细胞内聚集大量含有待降解产物的自噬泡(图5)。LC3的Western blotting也提示，CQ(10、40 μmol/L)可以导致细胞LC3蛋白特别是Ⅱ型蛋白表达显著升高(图6)。我们用不同剂量的CQ(10、40 μmol/L)干预GFP-LC3转染后的MHCC97-L细胞，6 h后细胞内就出现大量的点状荧光聚集，GFP-LC3阳性细胞显著增多(图7)。因此我们认为不同浓度的CQ均能导致肝癌细胞内自噬小泡及自噬蛋白聚积。图6~7可见，40 μmol/L CQ较10 μmol/L CQ在短时间内可导致更多的LC3-Ⅱ表达及GFP-LC3的聚集，因此大剂量CQ可能过度抑制自噬溶酶体内的蛋白降解，自噬泡不断增多却无法再生细胞内的营养物质，从而细胞发生自噬样死亡(即Ⅱ型细胞程序性死亡)。

图3　大剂量CQ作用24 h后诱导MHCC97-L细胞凋亡

图4　凋亡抑制剂Z-VAD-FMK无法抑制CQ诱导的细胞死亡

然而，通过RNAi干扰自噬关键蛋白Atg5的表达以及用自噬抑制剂3-MA(10 mM)预处理尽管抑制了自噬小泡的形成，但不能显著抑制 40 μmol/L CQ诱导的MHCC97-L细胞的死亡(图8)，这提示单独拮抗自噬同样不能抑制细胞死亡。

由此我们推测，CQ诱导的细胞死亡可能具有双重的特征。我们用caspase抑制剂Z-VAD-FMK的同时应用自噬抑制剂3-MA或用RNAi沉默Atg5的表达，PI染色后发现CQ诱导后的PI阳性MHCC97-L细胞显著减少(图9)。这提示，同时拮抗凋亡及自噬小泡形成，能够抑制CQ诱导的细胞死亡。因此，CQ诱导的肝癌细胞死亡既具有凋亡的特征又具有自噬样死亡的特征。

图5　CQ诱导肝癌细胞MHCC97-L内出现大量自噬泡

图6　Western blotting分析不同剂量的CQ

图7　GFP-LC3转染后的MHCC97-L细胞在经大

图8　siRNA沉默自噬关键蛋白Atg5或用自噬抑制剂3-MA

*P<0.05,**P<0.001)

图9同时用caspase抑制剂Z-VAD-FMK和自噬抑制剂

3-MA或RNAi沉默Atg5的表达后，PI染色分析

40 μmol/L CQ诱导的MHCC97-L细胞24 h的死亡情况

3讨论

自噬是细胞内的一种进化保守的过程，参与细胞内蛋白和细胞器的降解。自噬能够减少异常蛋白、陈旧细胞器的堆积，借此维持代谢平衡及内环境稳定。然而，过度刺激后，持续自噬将使细胞无法重新利用代谢产物来合成新的营养物质，从而导致细胞死亡(即Ⅱ型细胞程序性死亡)。

CQ是一种广泛应用的抗疟疾药物。研究[6-7]表明，CQ通过提高溶酶体PH值而抑制自噬体与溶酶体的融合以及自噬溶酶体内蛋白的降解。Amaravadi等[4]研究发现，CQ(5 μmol/L)可以抑制自噬降解机制，促进p53介导的肿瘤细胞凋亡。而Maclean 等[5]则认为，CQ(50 μmol/L)可以直接导致肿瘤细胞死亡，且既有凋亡的特征又有自噬性死亡的特征。因此，我们推测不同浓度的CQ对肿瘤细胞起着不同的自噬作用，从而造成了不同的结果。

我们应用不同浓度的CQ干预3种肝癌细胞，结果发现，只有CQ浓度大于20 μmol/L时，才会出现明显的肝细胞死亡，而小剂量CQ仅仅对细胞的增殖有轻微的抑制作用。自噬活性检测发现，不同剂量CQ均可以抑制自噬泡的降解，导致自噬小泡及自噬标志性蛋白在肿瘤细胞内积聚。大剂量CQ可能因过度抑制自噬溶酶体内的蛋白降解而导致细胞自噬样死亡和凋亡。

此外，有研究[5]表明，CQ诱导的肿瘤细胞死亡依赖于p53。然而，本研究发现，大剂量CQ也能够诱导p53表达缺失的Hep3B细胞的凋亡及自噬样死亡，初步提示CQ诱导的肝癌细胞死亡可能与p53的作用无关，但仍需进一步证明。

尽管大剂量CQ能直接导致肿瘤细胞死亡，然而大剂量应用CQ可能造成肝功能的损害。肝癌患者通常伴有肝硬化，肝功能常处于正常临界状态。因此，虽然大剂量CQ能抑制自噬、诱导肿瘤细胞直接死亡，但可能很难应用于肝癌的临床治疗。

综上所述，CQ可以抑制自噬降解，消除肿瘤细胞的自噬性保护；而过度抑制自噬性降解也会直接导致肿瘤细胞死亡，这种死亡形式既具有凋亡的特征又具有自噬样死亡的特征。

参考文献

[1]Lum JJ, Bauer DE, Kong M, et al. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis[J]. Cell, 2005,120(2):237-248.

[2]Mizushima N. Autophagy: process and function[J]. Genes Dev, 2007,21(22):2861-2873.

[3]Rashmi R, Pillai SG, Vijayalingam S, et al. BH3-only protein BIK induces caspase-independent cell death with autophagic features in Bcl-2 null cells[J]. Oncogene, 2008,27(10):1366-1375.

[4]Amaravadi RK, Yu D, Lum JJ, et al. Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma[J]. J Clin Invest, 2007,117(2):326-336.

[5]Maclean KH, Dorsey FC, Cleveland JL, et al. Targeting lysosomal degradation induces p53-dependent cell death and prevents cancer in mouse models of lymphomagenesis[J]. J Clin Invest, 2008,118(1):79-88.

[6]Paludan C, Schmid D, Landthaler M, et al. Endogenous MHC class II processing of a viral nuclear antigen after autophagy[J]. Science, 2005,307(5709):593-596.

[7]Shacka JJ, Klocke BJ, Shibata M, et al. Bafilomycin A1 inhibits chloroquine-induced death of cerebellar granule neurons[J]. Mol Pharmacol, 2006,69(4):1125-1136.

Mechanism Research on Death of Hepatic Carcinoma Cells Induced by Chloroquine

DINGZhenbinSHIYinghongPENGYuanfeiSONGKangZHOUJianFANJia

DepartmentofLiversurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the role of chloroquine (CQ) during inducing the death of hepatic carcinoma cells and to explore the clinical application of autophagy-related agents.Methods： Three kinds of hepatic carcinoma cell lines were chosen and treated with CQ at different concentrations for 24 hours. Then MTT assay was applied to determine the proliferation, and prodium iodide (PI) staining assay was used to detect the cell death. The specific apoptosis was examined by Hochest 33342 staining, TUNEL staining and Western blotting (caspase-9). The autophagic function was explored by GFP-LC3 redistribution, Western blotting (LC3), and electron microscopy.Results： MTT assay revealed that the proliferation of hepatic carcinoma cells was significantly inhibited by using CQ for 24 hours. The PI-positive cells increased significantly after the treatment with CQ (≥20 μmol/L) . Hochest33342 staining assay showed karyopyknosis and karyorrhexis. Meanwhile, TUNEL positive cells significantly increased and caspase-9 was activated. However, there was no significant change in the number of PI-positive cells after the CQ treatment at concentrations of 5 μmol/L and 10 μmol/L. CQ treatment resulted in significant increase of GFP-LC3-positive cells and expression of LC3-II. When the caspase inhibitor Z-VAD-FMK and 3-MA or Atg5 siRNA were applied at the same time, 40 μmol/L CQ-induced MHCC97-L cell death was significantly inhibited.Conclusions： CQ can inhibit the autophagic degradation of hepatic carcinoma cells, and resulted in the accumulation of autophagosomes and autophagic proteins. High-dose CQ directly induces the death of hepatic carcinoma cells, and the death has both characteristics of apoptosis and autophagic death.

Key WordsAutophagy;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis;Chloroquine

中图分类号R735.7

文献标识码A

基本项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81472219)

·论著·