OK—432肿瘤疫苗对小鼠肝癌细胞Hca—F抑制作用的研究

乔莎++赵彬

[摘要] 目的 研究探讨OK-432肿瘤疫苗对小鼠淋巴高转移肝癌细胞Hca-F的抑制作用。 方法 对DBA/2小鼠背部接种高转移肝癌细胞Hca-F，建立肿瘤转移模型，设对照组和OK-432肿瘤疫苗组，3周后测量肿瘤大小，并绘制肿瘤生长曲线，检测各组抑瘤率、淋巴结转移抑制率，淋巴结石蜡切片HE染色观察两组淋巴细胞数。 结果 OK-432肿瘤疫苗具有明显的抑瘤作用，抑瘤率达68.4%；淋巴结转移抑制率为31.6%；通过比较对照组和给药组淋巴结的HE染色，发现给药组淋巴结内淋巴细胞明显多于对照组。 结论 OK-432肿瘤疫苗能够有效抑制肿瘤生长，促进机体免疫应答，抑制肿瘤的淋巴结转移。

[关键词] OK-432肿瘤疫苗；淋巴结转移；抑瘤率

[中图分类号] R739.86 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）01-0001-03

Research on inhibitory effect of OK-432 tumor vaccine on mice' liver cancer cells Hca-F

QIAO Sha ZHAO Bin

Department of Stomatology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of OK-432 tumor vaccine on mice' highly lymph-metastatic liver cancer cells Hca-F. Methods Highly metastatic liver cancer cells Hca-F were planted in the back of DBA/2 mice and the tumor metastasis model was built. The control group and the OK-432 tumor vaccine group were set up， with 20 mice in each group. Three weeks later， the tumor size was measured， the tumor growth curve was drawn， the tumor inhibition rates and lymph node metastasis inhibition rates were detected， and the numbers of lymphocyte of the two groups were observed based on lymph gland paraffin section HE staining. Results OK-432 tumor vaccine had obvious tumor inhibition effects， with the tumor inhibition rate of 68.4%； The lymph node metastasis inhibition rate was 31.6%； Comparison of HE staining of the control group and the medication lymph node group showed that the number of lymphocyte in lymph node of the medication group was significantly larger than that of the control group. Conclusion OK-432 tumor vaccine can effectively inhibit tumor growth， promote body immune response and inhibit lymph node metastasis of tumor.

[Key words] OK-432 tumor vaccine； Lymph node metastasis； Tumor inhibition rate

近年来，肿瘤的发病率逐年增高且越来越年轻化，对患者的生命和健康造成严重的影响。目前全世界都在对肿瘤的预防和治疗进行研究。随着肿瘤药理学、分子生物学及免疫学等相关学科的快速发展和交叉渗透，肿瘤疫苗作为肿瘤治疗、放疗、化疗后的一种辅助治疗手段越来越受到人们的关注，本研究所用肿瘤疫苗为OK-432肿瘤疫苗[1]。OK-432肿瘤疫苗是通过菌体与癌细胞的直接接触，使肿瘤细胞变性并暴露瘤细胞“隐藏”着的某些抗原决定簇，从而达到增强肿瘤抗原性的目的。研究表明，OK-432肿瘤疫苗可以显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长及转移[2]，并延长其生存期。本研究将背部接种了高转移肝癌细胞Hca-F的DBA/2小鼠随机分为两组，分别给予腹腔注射OK-432肿瘤疫苗和生理盐水，观察OK-432肿瘤疫苗对肿瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性DBA/2小鼠40只，5～6周，体重16～20 g，购自北京维通利华实验技术有限公司。在SPF条件下喂养，实验前至少适应1周。

1.2 肿瘤细胞及培养方法

高转移肝癌细胞Hca-F购自于上海爱丁堡生物科技有限公司。KLN-205肿瘤细胞在37℃，5%CO2恒温箱传代培养，每次使用的培养液按照45 mL的RPMI-1640培养液加入5 mL胎牛血清，0.5 mL的双抗的比例配制。选取培养4代以上活力旺盛的肿瘤细胞作为靶细胞。

1.3 药物与试剂

OK-432为溶血链球菌减毒株冻干制剂，由中外制药株式会社（日本） 提供。青链霉素购自Solarbio公司；胰蛋白酶（含EDTA），无菌PBS，D-Hanks缓冲液；无支原体胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司出品。

1.4 荷瘤小鼠的制备、分组及给药方法

疫苗的制备按Li X等[1]的方法制备而成。将Hca-F肿瘤细胞在37℃，5%CO2恒温箱传代培养，每次使用的培养液按照45 mL的RPMI-1640培养液加入5 mL胎牛血清，0.5mL的双抗的比例配制。选取培养4代以上活力旺盛的肿瘤细胞作为靶细胞，用100 μL注射器及30#针头接种于DBA/2小鼠的背部（2×105/50 μL）。实验小鼠接种24 h后随机分为两组，每组20只，作为对照组（生理盐水）和给药组（OK-432肿瘤疫苗），接种24 h后开始给药，给药方式为腹腔注射，每只100 μL（5×105个），每周1次，连续给药3周。

1.5 肿瘤大小的测定

各组小鼠处理后每天观察肿瘤大小，每隔5天测量肿瘤最大径a和最小径b， 计算肿瘤体积。肿瘤体积=a×b×b×0.52（mm3）。

1.6 抑瘤率及淋巴结转移抑制率[3]

给药3周后处死小鼠，摘取腋下、腹部、胭窝处的淋巴结，根据淋巴结石蜡切片HE染色，计数淋巴结转移数， 剥离原发肿瘤，测定淋巴结重量，计算抑瘤率、淋巴结转移率及转移抑制率。

抑瘤率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照平均瘤重×100%；淋巴结转移率=同组转移小鼠数/同组小鼠数×100%；淋巴结转移抑制率=（对照组淋巴结转移率-给药组淋巴结转移率）/对照组淋巴结转移率×100%。

1.7 淋巴结HE染色

用40 g/L甲醛固定液固定淋巴结，常规方法石蜡包埋固定，制成4 μm的石蜡切片，进行HE染色，观察两组淋巴细胞浸润情况。

1.8统计学方法

应用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用方差分析，计数资料用相对数表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OK-432疫苗对DBA/2小鼠肿瘤增殖的抑制作用

腹腔注射OK-432疫苗及生理盐水后，每隔5天测量一次肿瘤的大小，计算肿瘤体积。见表1，应用SPSS17.0软件进行方差分析：5、10、15、20 d给药组与对照组差异均有统计学意义（P<0.01），OK-432肿瘤疫苗可以抑制肿瘤生长。以天数为横坐标，肿瘤的平均体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线，见图1。由图1可见对照组肿瘤生长速度明显高于给药组。

表1 两组肿瘤大小比较（x±s，mm3）

图1 肿瘤生长曲线

2.2 两组抑瘤率及淋巴结转移抑制率比较

给药3周后处死小鼠，摘取腋下、腹部、胭窝处的淋巴结（包括转移瘤），计数淋巴结转移数，测定原发肿瘤重量，计算抑瘤率、淋巴结转移率及转移抑制率见表2。疫苗组原发淋巴结重量明显低于对照组（P<0.01），抑瘤率为68.4%；淋巴结转移率疫苗组（65%）低于对照组（95%），有统计学差异（P<0.05），淋巴结转移抑制率为31.6%。OK-432肿瘤疫苗可以抑制肿瘤生长及肿瘤的淋巴结转移。

表2 两组淋巴结转移情况比较

2.3 小鼠转移淋巴结HE染色结果

从图2可见，对照组淋巴结内淋巴细胞明显少于给药组。OK-432疫苗可以促进机体免疫应答并可抑制肿瘤淋巴结转移。

图2 对照组（左）与给药组（右）小鼠淋巴结HE染色病理切片

3 讨论

肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物等激活机体免疫系统来产生抗肿瘤效应。它是一种新型的、主动免疫治疗肿瘤的方法[4]。OK-432[5-7]制剂是将A群溶血性链球菌（Su株）以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。OK-432肿瘤疫苗[8，9]是把OK-432与KLN-205癌细胞通过戊二醛（GA）架桥剂交联，剔除未结合的剩余物而制成。

本实验通过给接种了肝癌肿瘤细胞的小鼠腹腔注射肿瘤疫苗，观察肿瘤疫苗对小鼠肿瘤的抑制作用，结果显示，OK-432肿瘤疫苗可以抑制肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞的淋巴结转移，能够激活机体免疫，增强小鼠抗肿瘤能力。其抗肿瘤机制可能为：①OK-432肿瘤疫苗使菌体与癌细胞直接接触，利用OK-432直接杀伤癌细胞的作用使肿瘤细胞变性，能使细胞膜和细胞内的肿瘤抗原得到加工呈递与外露，从而肿瘤细胞“隐藏”着的某些抗原决定簇被暴露，使肿瘤抗原性增强得到增加[10，11]。②OK-432肿瘤疫苗可以激活宿主CD4+Th1细胞主导的细胞免疫，增强巨噬细胞和NK细胞的抗肿瘤作用，从而诱发CTL应答，使荷瘤小鼠肿瘤的生长得到显著抑制，延长小鼠生命，激发和增强宿主的特异性免疫功能[12]。

综上所述，OK-432肿瘤疫苗不仅可以抑制肿瘤的生长，而且可以增强机体免疫应答，并可抑制肿瘤的转移，值得临床上推广应用。

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（收稿日期：2014-07-29）