棉酚对雄性小鼠的生殖毒性作用

袁彦波，赵树臣，侯振中

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

棉酚是主要存在于棉花的叶、茎及种子中的一种有机物，是一种黄色结晶粉末，对人类和哺乳类有广泛的毒性作用。同时，棉酚还具有抗生育作用，对雄性动物的影响比较明显[1-2]，最早对棉酚的研究是用作男性的避孕药。已有大量文献报道棉酚及其衍生物能够影响精子的生成、成熟、受精，甚至导致不可逆的无精作用，所以被禁止使用。很长一段时间内棉酚都被认作是有毒废物，但有关棉酚具体生殖毒性机理的研究尚未见有太多详细的报道。20 d 灌服不同剂量的棉酚对雄性小鼠的生殖系统的的影响,为棉酚生殖毒性的研究提供实验基础，也为合理开发利用棉籽饼粕作为畜禽配合饲料及灭鼠提供科学参考。

1 材料

1.1 实验动物 4 周龄清洁级雄性小鼠48 只，体重20±2 g，由东北农业大学实验动物中心提供。在室温条件下常规饲养1 周，适应环境，用于试验。

1.2 主要试剂 棉酚，羧甲基纤维素钠，均购自哈尔滨伊事达生物工程有限公司。石蜡、甲醛、PBS、伊红、苏木精、乙醇、二甲苯、中性树胶等。

1.3 主要仪器 全自动石蜡切片机、全自动石蜡包埋机、恒温箱、熔蜡箱、摊片烤片机、染色机。

2 试验方法

2.1 分组 将48 只雄性小鼠随机分为4 组，每组12 只，1 个对照组，3 个试验组（30 mg/kg·d 组、60 mg/kg·d 组、240 mg/kg·d 组）。

2.2 称重 每周和处死前分别用电子天平进行称重并记录。

2.3 动物染毒及取材 各组小鼠均于每天上午9 点对其进行灌胃染毒1 次，试验组按30 mg/kg·d、60 mg/kg·d、240 mg/kg·d 剂量灌服由羧甲基纤维素钠稀释的棉酚0.4 mL，采用等体积不等浓度的方式，对照组仅灌服等体积的羧甲基纤维素钠，连续灌胃20 d，第21 天称重后处死小鼠，剖检取出睾丸，称其重量并计算脏器指数，并将睾丸置于4%多聚甲醛固定用于H.E.染色。

2.4 临床症状观察 灌胃后观察小鼠活动情况，食物消耗情况。并分别在染毒第7、14、21 天称量小鼠体重，观察体重增长情况。

2.5 睾丸形态学观察 将睾丸经4%多聚甲醛固定24 h 后进行洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色、中性树胶封片、加盖玻片，放置恒温箱中，于光学显微镜下观察。

2.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。结果以X±s表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。P＜0.01为差异极显著判断标准。

3 结果

3.1 棉酚对小鼠临床症状及体重的影响 灌服棉酚的小鼠，在服药后出现厌食，饮食和饮水量明显减少，活动能力减弱，出现被毛粗糙凌乱无光泽，高剂量组最为明显，并且在给药8 d 后出现死亡情况。中剂量组在给药13 d 后出现死亡现象，死亡小鼠剖检后发现胃肠臌气，有恶臭气味，其他脏器无明显眼观变化。对照组与低剂量组均没有出现死亡情况。体重变化情况见表1。

各组小鼠初始体质量差异均不显著（P＞0.05）。灌服棉酚后，试验第1 周，各组小鼠体重均呈上升趋势，体重差异都不显著（P＞0.05）；第2周开始，高剂量组体重开始呈下降趋势，体重差异显著（P＜0.05），其他各组体重还呈上升趋势，与初体重相比，对照组体重差异显著（P＜0.05）；第3周中剂量组体重开始呈下降趋势，高剂量组体重差异极显著（P＜0.01）。低剂量组与对照组，体重仍处于上升趋势。

表1 棉酚对雄性小鼠体重的影响 单位：g

3.2 棉酚对睾丸脏器指数的影响 与对照组相比，低剂量组睾丸脏器指数差异极显著（P＜0.01）；中剂量组睾丸脏器指数差异显著（P＜0.05）；高剂量组睾丸脏器指数差异不显著（P＞0.05）。说明棉酚对雄性小鼠睾丸发育有抑制作用。见表2。

3.3 睾丸病理组织学观察 对照组睾丸曲细精管固有结构清晰完整，基膜与间质之间界限清晰平整，间质较少，生精细胞排列紧密，整齐有序，生精细胞无脱落、变性、坏死等异常现象。与对照组相比，低剂量组睾丸结构个别生精细胞排列较疏松，间隙变大，其他的基本没变化；中剂量组生精上皮层数减少，间隙变大，曲细精管基膜有断裂现象，部分生精细胞与支持细胞分离，个别曲细精管内可见脱落的生精细胞，可见少量发育成熟的精子。高剂量组曲细精管形态不规则，边缘不完整，甚至没有曲细精管管腔，生精上皮变薄、层数减少，间隙增大。各级生精细胞肿大，排列紊乱并且伴随有细胞缺失和细胞碎裂，出现大量生精细胞脱落到管腔，可见少量发育成熟的精子，甚至没有发现成熟的精子（见图1）。

图1 不同剂量组病理组织学图片

4 讨论与小结

4.1 讨论 本文试验中，通过对4～5 周龄的雄性小鼠灌服不同剂量的棉酚，其体重、睾丸重及其脏器指数均有明显下降，在一定程度上说明棉酚对小鼠生长发育有一定的影响。试验结果显示，棉酚对雄性小鼠体重组间差异有显著性，灌服240 mg/kg·d 体质量浓度棉酚的小鼠第5 天开始食欲不振、出现肚子臌气、精神委靡等症状，消化机能出现紊乱现象，体重开始出现下降，第8 天开始小鼠有死亡现象，初步显示了棉酚能够导致雄性小鼠中毒死亡。特别是对睾丸影响最大，表现为随着剂量的加大，脏器系数下降，这与李根[3]等研究的结果相符。脏器指数是毒理学试验中，反应实验动物对脏器损害灵敏而有效的指标[4]，可以很好的反映药物对各个脏器的影响，尤其是反映毒性大小的重要指标。脏器指数增加表示脏器有充血、水肿、增生、肥大等变化，脏器指数下降表示脏器萎缩、退行性变化等[5]。H.E.染色结果显示，低剂量与中剂量组睾丸组织曲细精管结构及生精细胞有不同程度的损伤，高剂量组曲细精管形态不规则，边缘不完整，內缘排列很不规则，甚至没有曲细精管管腔，生精上皮变薄、层数减少，间隙增大。有的生精小管管壁变得疏松且遭到破坏，各级生精细胞肿大，排列紊乱并且伴随有细胞缺失和细胞碎裂，出现大量生精细胞脱落到管腔，可见少量发育成熟的精子，甚至没有发现成熟的精子。结果与研究报道的棉酚对雄性睾丸生精细胞有破坏作用，可以造成生精上皮细胞凋亡，造成死精、少精，甚至无精子症相一致[6-7]，表明，棉酚可以使鼠类不能生成成熟的精子，进而降低鼠类的繁殖能力。因此把棉酚应用到灭鼠剂中，可有效解决鼠类的繁殖问题，降低鼠害的发生率[8]。棉酚可以引起小鼠食欲下降，生长很明显受到抑制，体重下降。

4.2 小结 棉酚对雄性小鼠有一定的毒性作用，能使睾丸发生一定程度上的病理变化及能导致小鼠死亡，但对其机理还有待进一步的研究。

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