高铜日粮对肉鸡肝脏T rx2蛋白表达的影响

王荣梅，赵翠燕，闫文龙，陈立军

（1.韶关学院英东农业科学与工程学院，广东 韶关512005 ；2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广西 南宁530021）

高剂量铜作用于肉鸡会导致其铜中毒，已有研究表明，高铜会导致机体产生活性氧分子（ROS），而ROS 能够引起脂质过氧化损伤，线粒体型硫氧还蛋白2 系统（Trx2 系统）对清除体内自由基具有重要作用，它是一种存在于线粒体中的抗氧化系统，该系统为一个控制细胞还原/氧化状态和细胞增殖/生存的广泛表达的氧化还原系统，在线粒体内行使多种生物学功能[1]。线粒体型硫氧还蛋白2（Trx2）是该系统的组成成分之一，它是Trx 家族中一种线粒体特异性蛋白，它与锰型超氧化物岐化酶（Mn-SOD）以及还原型谷胱甘肽（GSH）构成线粒体重要的抗氧化防御系统[2]。本课题组之前的研究表明高铜日粮可导致线粒体硫氧还蛋白还原酶2 mRNA 在肝脏中的表达量降低，还原活性先升高后降低[3]。本试验旨在探讨高铜日粮对肉鸡肝脏Trx2 在基因表达和蛋白表达方面的影响，以更进一步研究高铜对动物肝脏线粒体抗氧化功能的损伤机理。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选用1 日龄Cobb 商品代肉鸡200只（购自深圳某种鸡场，平均体质量36 g±0.3 g），随机分为4 组，每组50 只。对鸡进行常规免疫，自由采食和饮水，24 h 光照。试验选用CuSO4·5H2O作为铜源，基础日粮对照组铜含量为Feedstuff 推荐的11 mg/kg（对照组，即Ⅰ组），高铜试验组分别为此标准的10、30 倍和50 倍，即110 mg/kg（Ⅱ组）、330 mg/kg（Ⅲ组）、550 mg/kg（Ⅳ组）。基础日粮以玉米、豆粕为主配制而成，蛋白质、能量以及维生素和微量元素添加量均按照NRC（1994）家禽营养需要配制。

1.2 主要试验材料 凝胶成像及分析系统（美国Perkin-Elmer 公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo IEC 公司）；PCR 仪（美国Perkin-Elmer 公司）；微量移液器（法国GILSON 公司）；BG-verMINI 迷你垂直电泳仪和BG-blotMINI 迷你垂直转移槽（美国BAYGENE 公司）；TS-2 型脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；手动匀浆器、RTPCR 试 剂 盒（TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2）；Trx2 鼠单抗（英国Abcam 公司）；羊抗鼠IgG-HRP（南京生兴生物公司）；GAPDH 标签抗体（36 kD）（康为世纪公司）。

1.3 样品采集 于试验的10 d、30 d 和50 d 每组随机选择5 只鸡宰杀、采集肝脏，单只肝脏一部分放入液氮中保存用于提取肝脏总RNA，另一部分置液氮中迅速冷冻，再置于-70 ℃保存，用于提取肝脏总蛋白以测定肝脏中Trx2 蛋白表达量。

1.4 肉鸡肝脏总RNA 的提取和测定 总RNA 提取按TaKaRa 公司的RNAiso Plus 试剂盒进行。紫外比色法测定总RNA 浓度和纯度，取10μg 总RNA，变性琼脂糖凝胶电泳分离、拍照观察RNA条带。

1.5 PCR 引物的设计及RT-PCR 反应 目的基因引物序列是根据GenBank 上鸡的Trx2、cDNA 序列按Primer6 软件自行设计的，引物序列见表1，由上海博亚工程技术服务有限公司合成。

表1 目的基因引物参数

参照TaKaRa 有限公司的One Step primeScript RT-PCR Kit Ver.2 操作说明书进行RT-PCR 反应。反应体系中模板即总RNA 为2 μg；经过多次条件优化、选择后，最终确定本试验反应条件为50 ℃30 min，94 ℃3 min，94 ℃30 s（变性），56 ℃40 s（退火），72 ℃50 s（延伸），3～5 步循环39次，72 ℃10 min。Trx2 和β-actin 目的基因的退火温度为56 ℃。

1.6 DNA 片段回收及测序 将鉴定准确的PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后按TaKa-Ra Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 操作说明书将DNA 片段进行回收，送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.7 PCR 扩增、电泳及灰度分析 按上述条件进行RT-PCR 扩增所要测定样品，取单个样品PCR 产物5 μL 在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳（EB 染色）。用Quanty One 图像分析软件系统分析条带灰度。目的基因条带灰度与β-actin 条带灰度的比值来表示Trx2目的基因丰度，亦即试验结果。每组5 个样品，每个样品做2 次重复。

1.8 Trx2 蛋白表达的测定 细胞裂解法提取肝脏组织总蛋白，考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，SDS-PAGE 凝胶电泳，Western blot 蛋白印迹，用凝胶成像分析系统进行扫描并进行灰度分析。每组目的蛋白条带吸光度（N）与相应的GAPDH 蛋白条带吸光度（A）的比值Y(Y=N/A)作为Trx2 蛋白表达的相对含量，亦即试验结果。每组5 个样品，每个样品做2 次重复。

1.9 数据处理 数据用-X ±SE 表示，应用SPSS 统计分析软件统计各组的试验数据，通过Ducans 新复极差检验法（DMRT 法）比较组间的差异。

2 结果与分析

2.1 高铜日粮对肉鸡Trx2 基因mRNA 表达的影响 组间比较，与对照组（Ⅰ组）相比，在对应试验时间点，除Ⅳ组50 d 时Trx2 mRNA 基因表达量降低，且差异显著（P＜0.05）外，其余组在各试验时间点与对照组相比虽略有升高，但差异不显著（P＞0.05）；组内比较，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组在30 d、50 d 较该组10 d 时Trx2 mRNA 基因表达量升高，但差异不显著（P＞0.05），Ⅳ组30 d、50 d 较该组10 d 时Trx2 mRNA 基因表达量降低，且50 d 时差异显著（P＜0.05），结果见表2。

2.2 高铜日粮对Trx2 蛋白表达的影响 组间比较，与对照组（Ⅰ组）相比，在对应试验时间点，Ⅳ组50d 时Trx2 蛋白表达量升高，且差异显著（P＜0.05），其余组在各试验时间点与对照组相比虽略有升高，但差异不显著（P＞0.05）；组内比较，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组在30 d、50 d 较该组10 d 时Trx2 蛋白表达量均升高，但只有50 d 时差异显著（P＜0.05），结果见表3。

表2 高铜日粮对Trx2基因mRNA表达的影响

表3 高铜日粮对Trx2蛋白表达的影响

3 讨论

ROS 在启动和调节细胞凋亡中扮演重要角色[4]，机体不断形成的低水平ROS 是正常氧代谢的部分产物[5-6]，然而当ROS 产生增加或保护系统功能降低时会导致氧化应激，大分子不可逆性损伤、琉基氧化，引起病理过程包括凋亡[7]。活性氧一方面在生物体内发挥着重要的生理功能，同时在一定条件下有成为损害生物机体的内在因子，诱导脂质过氧化，导致细胞结构和功能损害。高铜作用于肝脏细胞导致细胞内产生大量的ROS，ROS 攻击损伤细胞线粒体DNA（mtDNA）。mtDNA 编码13 条多肽均为氧化磷酸化酶复合体的亚基，在线粒体呼吸链电子传递和氧化磷酸化产能过程中发挥重要作用[8]。mtDNA损伤致使线粒体电子传递障碍和三磷酸腺苷（ATP）能量合成障碍，电子漏产生增加，生成大量ROS，加重靶细胞损伤[9]。由此可知，线粒体既是细胞内ROS产生的主要部位又是氧化损伤的主要靶细胞器[10]。因此，如何早期提高抗氧化能力、加强对线粒体保护、减少ROS 产生[11]是降低高铜日粮对肉鸡肝脏损伤的关键。

本试验结果表明，采用高铜日粮饲喂试验鸡后，Trx2 的mRNA 表达水平和蛋白表达水平在不同组别不同时期有一定的变化趋势。Ⅰ、Ⅱ组随着试验时间的延长Trx2 的蛋白表达量升高，但差异不显著（P＞0.05），同样该两组基因表达量也升高，差异不显著（P＞0.05），说明饲料中铜含量在110 mg/kg 时能够提高肝脏Trx2 的基因和蛋白表达量，从而增强肝脏的抗氧化性能、提高线粒体体呼吸功能，提高肉鸡的生长性能。Ⅲ组、Ⅳ组在30 d 和50 d 时蛋白表达量升高，且50 d 时差异显著（P＜0.05），但Ⅲ组基因表达量一直升高，Ⅳ组基因表达量降低且50 d 时差异显著（P＜0.05），由此表明，当日粮铜含量在550 mg/kg 饲喂50 d 时，Trx2 mRNA 基因表达量降低、蛋白表达量升高，提示高铜会影响Trx2 基因表达及蛋白表达过程，原因可能是因为机体具有代偿作用，日粮铜含量为330 mg/kg～550 mg/kg 饲喂一段时间以后（30 d～50 d 左右）肝脏受到损害，结合本课题组之前的研究结果[3]，铜作用下线粒体中的抗氧化系统功能降低，机体为了抵抗高铜带来的损伤而代偿性的提高硫氧还蛋白还原酶2（TrxR2）的活性，以大量还原氧化型Trx2 而达到修复肝脏Trx2 系统的作用，但是，铜同样可抑制Trx2 的基因表达，导致其基因表达量降低，机体为了达到清除越来越多的ROS 的目的，在TrxR2 活性的作用下，Trx2 蛋白表达量升高。

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