鸭1 型甲肝病毒亚型的鉴定

傅秋玲，陈 珍，黄 瑜，傅光华，陈翠腾，万春和，程龙飞，陈红梅，施少华，林建生

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州350013）

鸭1型甲肝病毒（duck hepatitis A virus 1，DHAV-1）是小RNA 病毒科（Pacornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）的成员之一，主要侵害6 周龄内的雏鸭，以发病急、病程短、致死率高、病死鸭呈角弓反张、肝脏肿大、出血为临床特征。

2005 年Guérin 等自表现胰腺炎和脑炎的番鸭中分离到鸭1 型甲肝病毒，而发病鸭肝脏未出现肿大、出血病变[1]。此后，未见类似病例报道。直至2011 年9 月，福建、浙江、上海、广东等省份相继出现10～30 日龄雏番鸭、半番鸭以胰腺泛黄、出血（俗称胰腺炎）为特征的疫病，其发病率和病死率分别达10%～30%、25%～40%。本研究室对患该病的雏番鸭病例开展了病原学研究，并对已分离到的病毒进行蚀斑纯化、形态特征、全基因组测序与分析、生物学及理化学特性和动物致病性试验等一系列相关研究，结果发现，该病毒呈直径20～40 nm 的球形粒子；其全基因组序列与DHAV-1 参考毒株核苷酸序列和氨基酸同源性分别介于93.5%～99.6%和97.9%～99.6%之间，结构蛋白vp1 基因与经典的DHAV-1 的vp1 基因序列同源性较高；对家禽红细胞和绵羊红细胞无血凝活性[2-4]；雏番鸭和雏半番鸭对该病毒较易感、樱桃谷雏鸭和雏麻鸭对该病毒不易感，而肝炎型的鸭1 型甲肝病毒却对樱桃谷雏鸭最易感，雏番鸭、雏半番鸭对其相对较不易感。综合以上研究结果，确定其病原为鸭1 型甲肝病毒。但由于其特征性剖检病变为胰腺泛黄、出血，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1（称为经典的肝炎型DHAV-1）所致的肝脏肿大、出血特征病变，为区别起见，将其暂定为胰腺炎型DHAV-1[2-4]。

为了明确引起雏鸭胰腺炎的新型DHAV-1 的分类地位，本研究采用固定病毒稀释血清的方法对胰腺炎型DHAV-1 和经典的肝炎型DHAV-1 进行血清交叉中和试验，以此分析胰腺炎型DHAV-1 与经典的肝炎型DHAV-1 间的抗原相关性，为对该病毒深入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 毒株和试验鸭胚 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株经典的肝炎型DHAV-1 由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室分离、鉴定和保存。10 日龄鸭胚（无DHAV-1 母源抗体），购自华南生物农大生物药品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阳性血清抗体、阴性血清抗体的制备 阳性血清抗体是胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）和经典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）病毒液分别经甲醛（终浓度0.1%）灭活后与弗氏不完全佐剂按1∶1 比例进行乳化，首次免疫成年番鸭，间隔2周后，与弗氏完全佐剂乳化后再次免疫，3 免后采集血液制备血清，应用鸭胚中和试验法测定抗血清效价，56 ℃灭活后分装冻存备用。阴性血清抗体的制备是采集自无DHAV-1 母源抗体鸭胚孵化而得的雏鸭，56 ℃灭活后分装冻存备用。

1.2.2 胰腺炎型与经典的肝炎型DHAV-1 鸭胚半数致死量（ELD50）的测定[7]分别对胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206株）和经典的肝炎型DHAV-1（FJ1007株）病毒液用灭菌PBS 进行10 倍系列稀释，将10-1-10-6每稀释度按0.1 mL/胚的剂量接种5 枚10 日龄番鸭胚，37 ℃孵育，弃24 h 内死亡胚，继续孵育1 周并观察记录鸭胚死亡结果，按Reed-Meunch法计算ELD50。

1.2.3 血清交叉中和试验 采用固定病毒稀释血清法[5]。首先将抗胰腺炎型DHAV-1 MPZJ1206 或经典的肝炎型DHAV-1 FJ1007 阳性血清用灭菌PBS 作倍比稀释。且将含200ELD50/0.2 mL 的病毒（MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 或FJ1007 株经典的肝炎型DHAV-1）分别与不同稀释度的阳性血清等量混合，于37 ℃孵育l h。同时，另设病毒、血清和PBS 对照，然后分别将各中和组混合液与对照组混合液按0.2 mL/胚的剂量接种于5 枚10日龄鸭胚尿囊腔内，弃24 h 内死亡胚，记录1 周内的鸭胚死亡情况，以病毒对照全部死亡及血清、PBS 对照全部存活为试验成立。试验组以1 周内有效死亡胚计算半数保护剂量（PD50）。以50%鸭胚保护的最高血清稀释度为血清的中和效价。

1.2.4 判定标准 参照《动物病毒学》中口蹄疫病毒血清型和亚型的区分标准进行判定[5]，由异源血清与同源血清效价之比得到2 个比值（r1 和r2），即MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 分别与抗经典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）阳性血清和抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）阳性血清之间反应测定的效价之比（r1）；FJ1007 株肝炎型DHAV-1 与抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）阳性血清和抗经典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）血清之间反应测定的效价之比（r2）。再根据公式亲缘值（R 值）：R=√r1×r2 计算得出。

2 结果

2.1 胰腺炎型与经典的肝炎型DHAV-1 的ELD50测定结果 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株经典的肝炎型DHAV-1 接种10 日龄鸭胚后，每天照胚3 次，统计1 周内鸭胚的死亡数量。按Reed-Meunch 法分别计算MPZJ1206 株胰腺 型DHAV-1 的ELD50为10-5.58/mL 和FJ1007 株 经典的肝炎型DHAV-1 的ELD50 为10-6.69/mL-1。

2.2 鸭胚交叉中和效价及R 值 采用固定病毒（200ELD50/0.2 mL）稀释血清法对胰腺炎型DHAV-1 毒株（MPZJ1206 株）和经典的肝炎型DHAV-1 毒株（FJ1007 株）进行鸭胚交叉中和试验。利用交叉中和抗体效价按公式计算两种间的亲缘值（R 值）（表1）：R=√r1×r2=√（89.1/169.8）×（91.2/125.9）=0.62。因此，R 值范围为0.32＜R＜0.7，表明胰腺炎型DHAV-1 属于鸭1 型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）。

表1 两种D H A V-1与相应抗血清交叉中和试验效价及R 值结果

3 结论与讨论

鸭甲肝病毒（DHAV）包含3种基因型，分别为传统的血清1 型鸭甲肝病毒、台湾新型鸭甲肝病毒和韩国型鸭甲肝病毒（即DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3），在我国主要流行DHAV-1 和DHAV-3[8-11]。雏鸭感染鸭甲肝病毒后多呈现角弓反张临床症状，肝脏呈特征性肿大、出血性病理变化，这些特征性的临床症状及剖检病变为临床快速诊断该病提供重要依据。直至2011 年下半年，我国浙江省金华、丽水等地及福建省的莆田、福州等地7～30 日龄的雏番鸭发生以胰腺泛黄、出血（暂称为胰腺炎）为特征的疫病。至今，浙江、福建、上海、广东、江西和广西6省（市、自治区）的雏番鸭和雏半番鸭均有发生此病，对我国的养鸭业构成极大危害。经过一系列研究发现，该病病原属于鸭1 型甲肝病毒。但胰腺炎型DHAV-1不能完全被经典的DHAV-1血清所中和[6]。这表明胰腺炎型DHAV-1 可能为DHAV-1 的亚型。

根据病毒抗原性的不同作为病毒分类的主要依据，特别是应用在划分同种病毒的不同型及亚型过程中。因为病毒与抗血清之间的中和反应极其敏感，且具有严格的种、型特异性。因此，通常采用血清交叉中和试验的方法判定不同毒株间的抗原关系[12]。毒株间亲缘关系与交叉反应的程度呈正相关[5]。例如与鸭肝炎病毒同属小RNA病毒的口蹄疫病毒利用血清交叉中和试验计算不同毒株间的R 值，以区分鉴定血清型及亚型。本研究利用鸭胚交叉中和试验测定了胰腺炎型DHAV-1 与经典的肝炎型DHAV-1 的交叉中和效价，计算得出胰腺炎型DHAV-1 与经典的肝炎型DHAV-1 的R 值，R 值的范围处于（0.32，0.7）之间，这表明胰腺炎型DHAV-1 属于鸭甲肝病毒的亚型（DHAV-1a）。因此本研究通过分析该病毒的抗原性明确了胰腺炎型DHAV-1 的分类地位，这为今后对该病毒进行深入的研究奠定基础。

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