动脉粥样硬化大鼠颈总动脉糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体的表达及意义

汪强　谷惠敏　王楷文

(江苏省昆山市第一人民医院心血管内科，*中心实验室，江苏昆山　215300)



·论著·

动脉粥样硬化大鼠颈总动脉糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体的表达及意义

汪强谷惠敏王楷文*

(江苏省昆山市第一人民医院心血管内科，*中心实验室，江苏昆山215300)

摘要目的： 通过检测动脉粥样硬化大鼠颈总动脉中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand， GITRL)的表达，探讨GITRL在动脉粥样硬化过程中的变化及意义。方法：建立大鼠动脉粥样硬化模型，取其颈总动脉，观察粥样硬化病变，采用免疫组织化学及蛋白质印迹(Western blotting)法检测GITRL的表达。结果：动脉粥样硬化大鼠颈总动脉的血管壁脂质沉积明显增多；弹性纤维不完整，连续性破坏、中断。动脉粥样硬化大鼠颈总动脉血管内GITRL的表达水平明显高于非动脉粥样硬化大鼠。结论：GITRL作为高脂饮食后表达上调的一种血管炎性分子，有望作为预测动脉粥样硬化发生的一种独立危险因素。

关键词动脉粥样硬化；糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体；炎性反应

当前，冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)已成为威胁人类健康的主要“杀手”。冠心病患者如果动脉壁上的斑块形成溃疡或破裂，则会形成血栓，重者使整个血管血流完全中断，而发生急性心肌梗死，甚至猝死[1]。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand，GITRL)是属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外区与其他TNF家族成员有20%的同源性。GITRL主要是组成性地高表达于血管内皮细胞或一过性在抗原提呈细胞(如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞)和一些肿瘤细胞表面表达[2]。GITRL是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)的天然配体，能够跨膜将膜外的信号转导到膜内。直接刺激GITRL可以像刺激GITR一样增强单核巨噬细胞的功能，诱导巨噬细胞聚集，以剂量依赖的方式上调细胞因子白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、IL-1和TNF-α的表达。GITRL在细胞的免疫反应、炎性反应等一系列生理病理过程中发挥着重要的作用。当内皮细胞受到损伤后，GITRL/GITR作为T细胞活化的共刺激分子，通过激发胞内信号来调控T细胞，进而诱发一系列的炎性因子、趋化因子的产生[3]。

本研究通过高脂饮食建立大鼠动脉粥样硬化模型，观察颈总动脉的血管病变及管腔的炎性反应程度，检测颈总动脉中GITRL的表达，探索GITRL可能的炎性反应机制。

1资料与方法

1.1实验动物及分组雄性SD大鼠60只，体质量150～250 g，购自上海斯莱克实验动物中心。将60只大鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组，每组30只。

1.2动脉粥样硬化模型建立正常饮食组以基础饲料喂养，高脂饮食组以高脂饲料喂养。高脂饲料配方：4%胆固醇，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86%基础饲料(购自上海斯莱克实验动物中心)。喂养时间为6个月。

1.3标本采集用10%水合氯醛溶液麻醉(0.1 g/100 g)大鼠，取颈部正中切口，暴露气管，用血管钳钝性分离颈总动脉、颈静脉及迷走神经，游离出一段长约2 cm的颈总动脉，在近心端和远心端分别结扎，剪断血管。将部分标本浸泡于10%甲醛溶液，用于病理分析，其余新鲜标本于液氮冰冻后用于分子生物学检测。

1.4病理组织学染色将标本用石蜡包埋后切片，片厚2 μm。漂片水温50℃，烘片温度90℃。将石蜡切片装上片架，置于60℃烘箱干烤1 h至石蜡融化，趁热依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、双蒸水中，各5 min。将脱水后的石蜡切片置于pH 6.0的0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液槽中，水浴加热至100℃，维持30 min。随后进行HE、油红“O”及弹力纤维(EVG)染色。

1.5病理诊断动脉粥样硬化的标准动脉粥样硬化大鼠动脉管壁增厚，平滑肌细胞增生，细胞排列紊乱，弹性纤维层结构不清，局部管壁向管腔突出，形成纤维增生性斑块(由平滑肌细胞及脂类堆积形成)。部分斑块表面出现纤维帽，纤维帽下由增生的平滑肌细胞、巨噬细胞及泡沫细胞组成[6]。

1.6GITRL表达的检测

1.6.1蛋白质印迹(Western blotting)法取冰冻的颈总动脉组织，加入预冷并预混有蛋白酶抑制剂cocktail的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液100 μL，匀浆震荡混匀，置冰浴裂解20 min，12 000 r/min 离心10 min后收集上清液，用BCA法测定蛋白样品浓度。将蛋白样品与等体积2×上样缓冲液混匀，置于100 ℃水浴，煮沸5 min。配制120 g/L聚丙烯酰胺凝胶，按照每泳道蛋白总量相等的原则计算上样量并上样，80 V电压下电泳20 min，待蛋白样品条带压缩后以100 V电压电泳90 min。300 mA恒流转膜3 h。取出PVDF膜，用30 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭1 h；以1∶200稀释的鼠抗GITRL抗体(美国Biolegend公司)在室温孵育3 h，TBST洗涤5 min，洗3次；以 1∶10 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育1 h，TBST洗涤5 min，洗3次；以 ECL-plus 为底物反应1 min后，用美国GE公司Typhoon分子成像系统扫描并记录结果。

1.6.2免疫组织化学法将经过抗原热修复的石蜡切片平铺在湿盒内，滴加甲醇稀释的3%过氧化氢溶液，室温放置30 min，以灭活内源性过氧化物酶；用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤5 min，重复3次；滴加3% BSA，封闭非特异结合位点，室温放置30 min；去除多余的BSA溶液，滴加以3% BSA溶液1∶200稀释的GITRL抗体，4℃过夜，次日晨取出；倒去多余的抗体溶液，用PBS洗涤5 min，重复3次，滴加3% BSA溶液 1∶200 稀释的生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBS洗涤5 min，重复3次，滴加以PBS 1∶100稀释的ABC溶液，37℃孵育1 h；用PBS洗涤5 min，重复3次，滴加3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色剂，室温显色，随时观察，适时终止显色反应。

2结果

2.1大鼠动脉粥样硬化模型的建立及验证2组大鼠喂养前体质量差异无统计学意义；喂养6个月后，高脂饮食组体质量高于正常饮食组(P<0.01)。在喂养的过程中，正常饮食组死亡4只，出现颈总动脉粥样硬化2只；高脂饮食组死亡6只，出现颈总动脉粥样硬化22只。与正常饮食组相比，高脂饮食组大鼠动脉粥样硬化发生率明显升高(P<0.01)。见表1。

表1正常饮食组与高脂饮食组大鼠一般情况比较(n,%)

项目正常饮食组(n=30)高脂饮食组(n=30)喂养前体质量/g196.3±10.1189.9±9.5喂养后体质量/g213.1±4.9572.3±8.7*死亡4(13.3)6(20)动脉粥样硬化2(7.7)22(91.7)*

注：与正常饮食组比较，*P<0.01

正常饮食组大鼠颈总动脉血管壁各层结构完整，内膜光滑，内衬单层内皮细胞，中膜由3～5层弹力膜和平滑肌细胞相间组成，细胞排列有序，外膜由结缔组织组成，EVG染色显示血管内壁弹性纤维完整、无中断；高脂饮食组大鼠血管内壁弹性纤维不完整，连续性破坏、中断；见图1。正常饮食组大鼠可见颈总动脉内膜完整、排列整齐，中膜平滑肌细胞体积、排列正常，内膜及中膜均未见泡沫细胞及脂质沉堆积，高脂饮食组大鼠内膜内皮细胞肿胀、变性，部分缺失，内膜明显增厚，含大量的泡沫细胞，中膜平滑肌细胞增生，内膜及中膜均可见泡沫细胞及脂质堆积。见图2。高脂饮食组大鼠血管壁脂质物质明显增多，见图3。

A：正常饮食组；B：高脂饮食组

A：正常饮食组；B：高脂饮食组

A：正常饮食组；B：高脂饮食组

2.2血管组织中GITRL的表达情况免疫组织化学结果显示，高脂饮食组颈总动脉血管组织表达的GITRL量明显增加，见图4。Western blotting结果也显示，高脂饮食组大鼠颈总动脉中GITRL蛋白表达水平较正常饮食组增加，差异有统计学意义，见图5。

A：正常饮食组；B：高脂饮食组

图5　Western blotting法检测正常饮食组和高脂饮食组

3讨论

动脉粥样硬化是全身性疾病，颈总动脉与冠状动脉粥样硬化之间有一定相关性，故颈总动脉粥样硬化可作为预测冠心病的独立因素[4-5]。动脉粥样硬化多发生在大、中动脉的血管壁，是由多种慢性炎性刺激引起的一系列病理改变，与低密度脂蛋白胆固醇水平增高、脂质堆积、内皮功能障碍、细胞聚集、局部血管平滑肌细胞迁移性增殖等因素密切相关[6]。血管内皮细胞具有控制凝血和纤溶、调节血管张力和血管生长的功能。血管损伤后，内皮细胞黏附、迁移并产生多种细胞炎性因子、趋化因子、细胞黏附分子和蛋白水解酶，引起白细胞黏附、血小板激活和血栓形成，并引起血管平滑肌细胞的增生、迁移和凋亡以及细胞外基质的增生和重构。内皮细胞不仅分泌缩血管物质(如内皮素1和血管紧张素Ⅱ)，还能分泌舒血管物质(如NO)。动脉粥样硬化即内皮细胞功能受损致使内皮素/NO平衡失调并由此导致血管收缩和平滑肌细胞增生的一种病理状态。

虽然，目前GITR/GITRL的作用机制还不明确，但许多动物模型的研究已经证实，体内GITR与其配体GITRL结合能够促进免疫系统过度活化，从而诱发或增加一系列炎性因子的表达。

本研究结果发现，动脉粥样硬化组大鼠颈总动脉组织中GITRL的表达水平较正常饮食组大鼠明显升高，提示GITRL可以作为诊断动脉粥样硬化的相对特异的生物标志物及血管炎性反应的预测指标。今后可通过进一步研究血浆中GITRL与其他相关因素的关系以及在冠心病人群中开展研究确定GITRL在冠心病诊断治疗中的价值。

参考文献

[1]Acar RD, Bulut M, Ergün S, et al. Does cardiac rehabilitation improve left ventricular diastolic function of patients with acute myocardial infarction？[J]. Turk Kardiyol Dern Ars, 2014,42(8):710-716.

[2]Liu Y, Tang X, Tian J, et al. Th17/Treg cells imbalance and GITRL profile in patients with Hashimoto′s thyroiditis [J]. Int J Mol Sci, 2014,15(12):21674-21686.

[3]Carrier Y, Whitters MJ, Miyashiro JS, et al. Enhanced GITR/GITRL interactions augment IL-27 expression and induce IL-10-producing Tr-1 like cells [J]. Eur J Immunol, 2012,42(6):1393-1404.

[4]Lloyd-Jones DM, Walsh JA, Prineas RJ, et al. Association of electrocardiographic abnormalities with coronary artery calcium and carotid artery intima-media thickness in individuals without clinical coronary heart disease (from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA)) [J]. The American Journal of Cardiology, 2009,104(8):1086-1091.

[5]Zhang Y, Guallar E, Qiao Y, et al. Is carotid intima-media thickness as predictive as other noninvasive techniques for the detection of coronary artery disease?[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology,2014,34(7):1341-1345.

[6]Gratchev A, Ovsiy I, Manousaridis I, et al. Novel monocyte biomarkers of atherogenic conditions [J]. Current pharmaceutical design, 2013,19(33):5859-5864.

基本项目：国家自然科学基金(编号：31400131；81401677)

Expression and Significance of Glucocorticoid-Induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand in Carotid Artery of Rats with Atherosclerosis

WANGQiangGUHuiminWANGKaiwen*DepartmentofCardiovascularMedicine,*TheCentralLaboratory,TheFirstPeople′sHospitalofKunshan,Kunshan215300,China

AbstractObjective： To explore the change in the expression of glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand(GITRL) in atherosclerotic process and its significance, by detecting the expression of GITRL in carotid artery of rats with atherosclerosis.Methods： Rat model of atherosclerosis was established and the atherosclerotic lesions were observed. The expression of GITRL in carotid artery was analyzed by immunohistochemical method and Western blotting. Results： The lipid deposition increased significantly in carotid artery of rats with atherosclerosis. The elastic fibers were incomplete and discontinuous. The endovascular expression level of GITRL was significantly higher in the carotid artery of atherosclerosis rats than that in the carotid artery of non-atherosclerosis rats.Conclusions： As a vascular inflammatory molecule, produced after high-fat diet, GITRL may become an independent risk factor for predicting the occurrence of atherosclerosis.

Key WordsAtherosclerosis；Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand；Inflammatory reaction

中图分类号R

文献标识码A