储存条件对全血样本他克莫司血药浓度监测的影响

西娜 刘超

储存条件对全血样本他克莫司血药浓度监测的影响

西娜 刘超

目的 考察两种储存条件对全血样本他克莫司血药浓度监测结果的影响。方法 采集临床肾移植术后患者口服他克莫司后12 h静脉全血样本20份，分别在室温(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光储存，用化学发光微粒子免疫法测定0、24、72 h时他克莫司的血药浓度。结果 全血样本在两种储存条件下72 h内，他克莫司的血药浓度无显著性变化(P＜0.05)，RSD＜5%。结论 他克莫司全血标本在室温(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光储存72 h内保持稳定，不影响测定结果，故因特殊情况不能及时送检的样品在上述两种储存条件下72 h内仍有检测价值。

他克莫司;血药浓度监测;储存条件;全血

他克莫司(tacrolimus，FK506)系从放射花线菌的发酵液中提取的大环内酯类抗生素，是第二代免疫抑制药的代表性药物，广泛用于器官移植的抗排斥反应，如肝移植、肾移植、肺移植、角膜移植等，具有药效强、使用剂量低、器官存活率高、急性排斥反应发生率低等特点［1］。研究证实，FK506在体内和体外抑制淋巴细胞活性的能力比环孢素强10～100倍，且应用其防止排斥反应的有效剂量不到环孢素的1/100～1/10［2］。但它口服吸收生物利用度及药物动力学个体差异较大，导致个体浓度波动较大［3］。FK506浓度过高时易导致毒性产生如神经毒性、肾毒性和高血糖发生［4］，过低时易并发急性排斥反应［5］。因此需对其进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)，以使免疫抑制药的安全性和疗效达到最优化［6］，减少医生仅凭借临床经验及患者用药反应来调整给药剂量带来的盲目性［7］。来中国人民解放军第309医院进行移植术后FK506血药浓度监测的外地患者占很大比例，因血液成分复杂，故未离心处理的全血样本在放置一段时间后，其检测结果的准确性是否受到影响是一个必须要面对的问题。许多患者纷纷咨询血样是否必须在取血当天测定，其保存温度有何特殊要求等等，为给患者一个科学、满意的答复，我们对他克莫司全血样本保存的稳定性进行了考察，报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 ARCHITECT i1000型全自动化学发光免疫分析仪(美国Abbott公司);XSYSTEMS 9527-26离心机(SIGMA公司);Mixmate涡旋混匀仪(EPPENDORF公司);BE-2011振荡器(海门市其林贝尔仪器制造厂);美菱BCD-205L3C冰箱(合肥美菱股份有限公司);EN05239微量加样器100 μl(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 试剂 ARCHITECT 1L77他克莫司专用试剂盒(美国 Abbott公司，批号 29268M500);ARCHITECT 1L77他克莫司专用试剂盒定标液(美国Abbott公司，批号29268M500);ARCHITECT 1L77-55他克莫司全血沉淀剂20.4 ml(美国Abbott公司，批号308518);1P05-10雅培免疫抑制剂-复合质控品2 ml(美国Abbott公司，批号47k14313)。

1.3 方法

1.3.1 仪器检查校正:按照ARCHITECT i1000操作手册开机自检。

1.3.2 FK506全血药物浓度的测定及质量控制。

1.3.2.1 样本采集:FK506全血药物谷浓度的样本采集应于患者末次服用FK506后12 h进行［8］，血液样本取自肾移植术后患者外周静脉，样本采集量不少于2 ml，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.3.2.2 样本测定:全血样本摇匀后，精密吸取血样200 μl置于离心管中，加入蛋白沉淀剂 200 μl，于涡旋振荡器上振荡10 s，再用高速离心机以13 000 r/min(离心半径8 cm)离心4 min，取上清液至样品管，再涡旋振荡10 s，放入ARCHITECT i1000中进行检测。

1.3.2.3 仪器定标与精密度试验:试验前对ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪的FK506试剂盒定标，定标浓度分别为 0、3、6、12、20、30 ng/ml，仪器通过定标并自动生成标准曲线。连续5 d对随行质控进行测定，质控品分为低(4.64 ng/ml)、中(8.81 ng/ml)、高(16.80 ng/ml)3个浓度。

1.3.2.3.1 日内精密度:分别吸取3个浓度的全血质控样本，按“2.2.2”项下方法进行测定。每个浓度的质控样本经处理后各进样5次，记录数值，求出平均值、SD及RSD，计算日内精密度。

1.3.2.3.2 日间精密度:分别吸取3个浓度的全血质控样本，按“2.2.2”项下的方法进行测定。每个浓度的质控样本经处理后于5 d内分5次进样，记录数值，求出平均值、SD及RSD，计算日间精密度。

1.3.2.4 实验分组与血样储存稳定性研究:随机抽取40份来我院需监测FK506浓度的肾移植术后患者的全血样本，其中男23份，女17份;年龄24～65岁。随机均分为2组，每组20份样本。取血当天测全血药物浓度，再将1～20号样本常温(25℃)避光放置24 h、72 h，21～40号样本于冰箱冷藏室(4℃)避光放置24 h、72 h，按“2.2.2”项下方法测定每个样本放置24 h与72 h后的FK506浓度。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，将1～40号样本24、72 h的测定结果与0 h的测定结果分别进行双侧配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仪器定标 标准曲线方程为:y=4.8×10512727x，相关系数r=0.9980，相关性佳。

2.2 精密度试验 在标准曲线范围内，全血中他克莫司3个浓度的质控样本测定结果如下表，RSD均＜5%，符合2010年版《中国药典》对生物样品检测相对标准偏差应＜15%的要求。见表1、2。

2.3 血样储存稳定性研究 常温组(1～20号样本)与冷藏组(21～40号样本)在储存24、72 h后他克莫司血药浓度的RSD均＜15%，有临床参考意义。常温组与冷藏组共40个样本在同一条件储存不同时间，其测定结果差异均无显著性差异(P＞0.05)，显示样品稳定，对临床因特殊情况不能及时送检的样品在上述两种储存条件下72 h内仍有检测价值。见表3、4。

表1 全血中他克莫司浓度测定日内精密度考察结果

表2 全血中他克莫司浓度测定日间精密度考察结果

表3 他克莫司全血样本25℃、4℃条件下储存的浓度变化

3 讨论

目前FK506血药浓度监测方法有微粒子酶免疫法(MEIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶放大免疫法(EMIT)、化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)和高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等。CMIA法是用于FK506血药浓度监测的最新方法。它是将化学发光原理与竞争性免疫测定相结合形成的分析技术，同时具有化学发光的高灵敏度和免疫测定的特异性，分析不受样品中高浓度的血红蛋白、脂类、胆红素的影响，与其他方法的相关性好，适合临床常规监测使用［9］，具有特异性好、敏感性高、可定量、全自动操作、重复性好等优点［10］。作为全军移植中心，我院移植患者数量较多，CMIA法的检测范围较大，比较适合我院使用。

表4 他克莫司全血样本25℃、4℃保存时血药浓度稳定性的t检验结果 n=20

检测他克莫司血药浓度时，通常采用全血来做为检测标本，这是因为:(1)全血/血浆中他克莫司浓度的分布为20∶1，全血中药物浓度较高，更易达到检测灵敏度要求;(2)血浆浓度稳定性高，但比全血浓度变异性大;(3)患者个体差异较大，血药达峰时间并不一致，故他克莫司血药浓度监测为全血谷值浓度，采血时间便于掌握且波动较小，所以临床检测一般不用血浆而以全血为主［11］。

在临床治疗药物剂量调整时，医生需要综合考虑患者的病理状态、生理生化指标及体内药物浓度之间的相关性来做出准确的判断，而治疗药物监测所提供的血药浓度的准确性是做出这种正确判断的基础。因此，我们认为需要建立良好的质量控制标准、可行的质量控制评价，避免或减少由于测定本身带来的误差。故实验前进行了仪器定标与精密度试验，结果显示低、中、高3个浓度的RSD均小于5%，符合2010年版《中国药典》对生物样品检测相对标准偏差应小于15%的要求，亦确保本实验数据可靠。

经笔者检索相关文献，口服他克莫司患者的全血标本在不同储存条件下的稳定性考察尚未见报道。通常我们收到样本后会尽快检测，以免影响浓度测定结果。而本研究结果表明，全血标本在室温(25℃)和冰箱冷藏(4℃)储存72 h内，所测定的他克莫司血药浓度结果无显著性差异(P＞0.05)，为临床储存他克莫司全血标本的条件提供了实验参考依据;并提示日常监测时我们可在保证结果准确的前提下灵活掌握测定时间，外地患者也可根据实际情况灵活选择送血样的时间和方式，不必急于当天将样品送到实验室进行测定。对于其他季节的不同室温以及更长时间对他克莫司血药浓度测定的影响将会在今后的工作中进一步考察。

1 王华光，王鹤尧，龙江.他克莫司临床应用的新进展.中国药物应用与监测，2004，1:5-7.

2 Alshaibani K，Nizamuddin N，Raza S，et al.University of Wisconsin versus Eurocollins solution for kidney preservation:analysis of clinical outcome.Transplant Porc，1998，30:3681-3682.

3 王华光，孔翠，于晓佳，等.FK506和环孢素在器官移植领域的药物基因组学研究现状.中国药师，2011，14:1518-1521.

4 Kurtoglu EL，Yuksel S.Genotoxic effects of tacrolimus on human lymphocyte cells.Genetika，2012，48:762-768.

5 季曙明，文吉秋，程东瑞，等.采用程序化肾活检评估肾移植后低水平和标准水平FK506的疗效.器官移植，2012，3:95-101.

6 张善堂，唐丽琴，聂松柳.免疫抑制剂的治疗药物监测研究进展.中国临床保健杂志，2012，15:433-436.

7 刘俊，江佳.268例丙戊酸血药浓度监测结果分析.安徽医药，2012，16:1182-1183.

8 姬怀雪.他克莫司血药浓度监测注意事项与用药指导.中国现代医药杂志，2011，13:118-119.

9 Bazin C，Guinedor A，Barau C，et al.Evaluation of the Architect tacrolimus assay in kidney，liver，and heart transplant recipients.J Pharm Biomed Anal，2010，53:997-1002.

10 Marangoni A，Sambri V，Accardo S，et al.Evaluation of LIAISON Treponema Screen，a novel recombinant antigen-based chemiluminescence immunoassay for laboratory diagnosis of syphilis.Clin Diagn Lab Immunol，2005，12:1231-1234.

11 潘继文.应用微粒子酶免疫法测定肝移植他可莫司的血药浓度评价.实用药物与临床，2008，11:99-100.

R 914.1

A

1002-7386(2015)18-2849-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．18．046

100091 北京市，中国人民解放军第309医院药剂科(西娜);河北北方学院医学院药学系(刘超)

2015-03-18)