正交实验法确定坤净泡腾胶囊栓最优提取方案

任 娜，刘 杰，吴 伦，田振坤

(黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨150040)

正交实验法确定坤净泡腾胶囊栓最优提取方案

任 娜，刘 杰，吴 伦，田振坤

(黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨150040)

通过正交设计法与紫外可见分光光度法确定坤净泡腾胶囊栓提取的最优方案.采用L9(34)正交实验法设计实验，以柴胡总皂苷的得率为考察指标，以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数作为考察因素，各因素取3个水平进行考察，采用紫外可见分光光度法，以柴胡皂苷d为对照品，在波长543 nm处对样品中的总皂苷进行测定，进行统计分析，筛选最优工艺.最优的提取条件为12倍量80%的乙醇，提取3次，每次0.5 h.优选后的提取工艺柴胡总皂苷的提取效率最高，可增加各处方药材的利用率.

正交实验法；坤净泡腾胶囊栓；柴胡总皂苷；最优提取方案

当今社会，阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂等妇科疾病困扰着越来越多的女性，给广大女性的工作生活带来很多不便.许多专家学者对这一方面的疾病进行了研究，而坤净泡腾胶囊栓是由柴胡、火绒草、呋喃唑酮等中西药混合而成的一种栓剂，专门治疗阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂的女性疾病.具有清热燥湿，去腐生肌的功能.泡腾胶囊栓的君药是柴胡、火绒草和呋喃唑酮，柴胡中的柴胡皂苷d为药材的主要药理活性成分[1]，故以柴胡皂苷d作为研究指标进行总皂苷量的测定.采用正交实验法L9(34)优化提取条件，以柴胡皂苷d的量作为指标测定，研究并确定坤净泡腾胶囊栓的最佳提取工艺.

1 实验材料和仪器

柴胡皂苷d标准品(批号：110778-200402)：由中国药品生物制品检定所提供；电子分析天平(万分之一)：Mettler Toledo AL204；DT系列电子天平：中国江苏常熟长青仪器仪表厂；756P型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；对二甲氨基苯甲醛、甲醇等均为分析纯.柴胡购于哈尔滨市松茂药材站，经鉴定为伞形科柴胡属植物北柴胡(bup-leurumchinense DC.)的根.

2 方法与结果

2.1.1检测波长的选择

以甲醇配制一定质量浓度的柴胡皂苷d溶液，精密吸取0.2 mL加入0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL70 ℃反应10 min，冷却，加入磷酸4.0 mL70 ℃反应30 min，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录VA)于200～800 nm范围内进行波长扫描.结果在543 nm处，有最大吸收峰，故确定检测波长为543 nm.结果见图1.

图1 柴胡皂苷d的检测波长

2.1.2对照品溶液的制备

精密称取5.00 mg柴胡皂苷d对照品，用甲醇定容到5 mL容量瓶中，制成1 mg/mL的溶液，摇匀，即得.

2.1.3标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL分别置10mL具塞试管中，加甲醇稀释至1 mL，加入0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液1 mL摇匀，于70 ℃反应10 min，取出，放冷，加入磷酸5.0 mL 70 ℃反应30 min，取出，放冷，于543 nm处测定吸收度.以吸收度值A为纵坐标，柴胡皂苷d的质量浓度(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：A=0.79 244C-0.004 09，r2=0.999 74.表明在0.1～1mg范围内柴胡皂苷d的量与吸收度值呈良好的线性关系.

2.1.4精密度试验

近年来，中央及各地政府机构加大财政投入，加强资源整合，在农村地区开展卫生治理、村庄环境建设、道路修建等一系列基础建设工作，使得乡村呈现出天蓝、水绿、村民安居乐业的美好景象。

精密吸取0.6 mL对照品溶液，置10 mL具塞试管中，加甲醇至1.0 mL，制成0.6 mg/mL对照品溶液，按“2.1.3”项方法操作，于543 nm处测定吸收度，测定6次.计算对照品的RSD值为0.26%.

2.1.5稳定性试验

取精密度项下的第6号样品按“2.1.3”项方法操作，于0、6、12、24、36、48 h测定吸收度.结果RSD为0.19%.对照品溶液在48 h内基本稳定.

2.1.6重复性试验

平行吸取6份0.6 mL对照品溶液，置10 mL具塞试管中，加甲醇至1.0 mL，制成0.6 mg/mL对照品溶液，制备供试品溶液，按“2.1.3”项方法操作进行测定.计算RSD值为0.19%，表明重现性良好.

2.1.7加样回收率试验

精密称取已知量的同一批样品9份，按照高、中、低剂量加入柴胡皂苷d标准品，按“2.1.3”项方法操作并测定.结果的平均回收率为99.85%，RSD为0.29%.

2.2 正交试验

2.2.1正交设计

根据预试验和文献[2-4]报道，影响中药有效成分提取工艺的主要因素为乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数、提取时间等.本研究以柴胡总皂苷的量作为测定指标，每个因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验，因素水平见表1.

表1 各因素水平表

水平乙醇体积分数/%乙醇用量/倍提取次数提取时间/hABCD123607080610121230．51．52 0

2.2.2结果分析

直观分析：通过比较各因素的极差值可以看出，影响柴胡总皂苷的因素顺序为A>B>D>C，最佳提取条件是A3B3C2D1.具体结果见表2.

表2 九次实验柴胡总皂苷测定结果

实验号因素ABCD柴胡总皂苷的量/%1111112．69212229．963133312．5654212315．5995223114．046231215．8767313217．5248321318．0569332121．128I11．73815．27115．54115．953II15．17214．01915．56214．453III18．90316．52314．71015．407极差R7．1652．5040．8521．500

方差分析：可以看出影响总皂苷的量的因素中，A和B差异有显著性(P<0.05)，表明乙醇体积分数和乙醇用量对总皂苷量的影响显著，其他因素未见有显著影响.四因素的影响大小依次为A>B>C>D.具体结果见表3.

表3 各因素方差分析表

因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性乙醇体积77．036254．32719．000P<0．05分数9．40826．63519．000P<0．05分数3．45522．43719．000提取次数1．41821．00019．000提取时间误差1 422

注:F0.05(2, 2) = 19F0.01(2, 2) = 99.

综合直观分析和方差分析，最优工艺为A3B2C1D3，即10倍量80%乙醇提取1次，每次2 h，但考虑柴胡皂苷为主要的药效成分和实际生产情况，最终确定的最佳提取条件为：A3B3C3D1，即用12倍量的80%体积分数乙醇提取3次，每次0.5 h.

2.2.3工艺验证

按最优提取条件进行验证试验，结果证明所选工艺条件提取率最高，吸光度为1.755，柴胡总皂苷的量为18.871%.

3 讨 论

正交设计是一种高效率、快速、经济的设计方法.L9(34)正交试验设计，通过比较醇提量、醇提体积、提取时间和提取次数，以柴胡皂苷d为测量指标，用紫外分光光度法进行测量，对工艺进行优化.皂苷类是柴胡的主要成分之一.实验结果表明，4个因素中对提取率影响最为显著的因素是乙醇体积分数和乙醇用量.在实验范围内，乙醇体积分数越高，用量越大，柴胡皂苷d的量越高.而提取次数和提取时间比较不明显，可能和乙醇挥发，提取剂质量浓度降低有关.本文采用文献[5-6]中对二甲氨基苯甲醛-磷酸法则测定柴胡中柴胡皂苷d的量，从验证结果可以看出，最佳工艺的提取效果稳定，所得的提取物的量较高.该工艺简单，可行性高，可以为以后的生产提供可靠的参考和指导.

[1] 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010. 124.

[2] SUN Y, WEI L, WANG J,etal. Optimization of supercritical fluid extraction of saikosaponins from Bupleurumfalcatum with orthogonal array design [J].J Sep Sci., 2010, 33(8): 1161-1166.

[3] 彭支莲, 张 丹, 李业洪, 等. 正交法优选续断中绿原酸的提取工艺[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(7): 269-270.

[4] 赵森铭. 正交实验法优选柴黄咀嚼片的提取工艺[J]. 北方药学, 2013, 10(7): 56-57.

[5] 浦锦宝, 胡轶娟, 梁卫青, 等. 紫外可见分光光度法测定柴胡中柴胡总皂苷的含量[J]. 医学研究杂志, 2008, 37(6): 98-100.

[6] 张文娓，崔 阔，谢 明，等.萆术硝痛颗粒提取工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2015，31(4)：389-392.

Optimum extraction program of Kunjing effervesce capsule plug using orthogonal experimental method

REN Na, LIU Jie, WU Lun, TIAN Zhen-kun

(Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To determine the optimal extraction program of Kunjing effervesce capsule plug by orthogonal experimental method with UV-visible spectrophotometry. By using the L9(34) orthogonal experimental method, the saikosaponin extraction rate and the extractum rate of the saikosaponin d were investigated. The ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and extraction times were used as investigation factors and three levels of each factor were investigated. By using UV visible spectrophotometry, with saikosaponin d as

tandard, the content of total saponins was determined at 543 nm. The optimal process was screened using statistical analysis. Results indicated the optimum extraction conditions were as follows: the concentration of ethanol 80%, 12 times the volume, extraction time of 30 min, extracting times of three. After the optimization of extraction the efficiency of saikosaponin d was the highest, and it could increase the utilization of various prescription medicines.

orthogonal experiment; Kunjing effervesce capsule plug; radix bupleuri total saponins; optimum extraction program

2015-08-10.

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目(12541736)；黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目(12541755)；黑龙江中医药大学新药研究基金项目(2013xy02)；黑龙江中医药大学博士创新基金项目(2012bs02)

任 娜(1990-)，女，硕士，研究方向：中药创新药物研究.

田振坤(1955-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药创新药物研究.

R286

A

1672-0946(2015)06-0664-03