毛细管电泳法测定L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒中2种主成分的含量Δ

周 洁，左利民，王智亮，姜 威，任连杰，山广志#（.中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 00050；.潍坊市人民医院，山东 潍坊 604；.北京市药品检验所，北京 0005）

L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒（L-glutamine and sodium gualenate granules，商品名：麦滋林）是日本寿制药株式会社生产的以L-谷氨酰胺与呱仑酸钠为主成分的复方制剂，主要用于治疗口腔溃疡[1]、胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡[2]等疾病。

因L-谷氨酰胺与呱仑酸钠极性不同，且含量相差悬殊，同时测定二者含量相对困难。在L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒进口注册标准[3]中，分别采用定氮法和高效液相色谱（HPLC）法对L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的含量进行测定。另有文献报道，利用紫外分光光度法[4]、反相高效液相色谱（RP-HPLC）[5]法等方法检测呱仑酸钠含量，采用HPLC法[6]、纸层析法[7]、毛细管电泳法[8]等方法以及借助氨基酸自动分析仪[9]检测L-谷氨酰胺的含量。最近有研究人员采用离子对HPLC法，以乙腈-0.05%癸烷磺酸钠溶液为流动相，实现了L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒中L-谷氨酰胺与呱仑酸钠含量的同时测定[10]。

毛细管电泳法以绿色、经济、环保、简便等特点广泛应用于药物分析的各个领域，尤其适合带电物质的分离，是传统RP-HPLC方法的有效补充。本文尝试采用成本低、柱效高的毛细管电泳法同时测定L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒中2种主要成分的含量，以为国内产品的药品标准提高，以及极性较强且酸碱性相差悬殊的复方制剂的开发、质量研究与控制提供参考和借鉴。

1 材料

P/ACE MDQ毛细管电泳系统（美国Beckman Coulter有限公司）；CP214型电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；Integral 10型超纯水仪（德国Merck Millipore公司）；无涂层石英毛细管柱（河北永年光导纤维厂）；Seven Easy S20 pH计（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

L-谷氨酰胺对照品（美国Agilent Technologies有限公司，批号：BCBG1414V，纯度：100.0%）；呱仑酸钠对照品（日本寿制药株式会社，批号：I07N，纯度：100.6%）；L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒样品（日本寿制药株式会社，批号：S49P、S56Q，规格：0.67 g/袋，每袋含L-谷氨酰胺663.3 mg、呱仑酸钠2.0 mg）；十水合四硼酸钠、硼酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 电泳条件

色谱柱：采用无涂层石英毛细管柱（总长度60.2 cm，有效长度50 cm，内径50 μm）；运行缓冲液：40 mmol/L硼砂缓冲液（pH＝9.22）；样品缓冲液：4 mmol/L硼酸缓冲液（pH＝6.97）；温度：20 ℃；进样方式：压力进样；进样压力：0.5 psi；进样时间：5 s；分离电压：15 kV；检测波长：220 nm。

试验前石英毛细管柱分别用0.1 mol/L氢氧化钠冲洗20 min，超纯水冲洗5 min，运行缓冲液冲洗5 min，以保证毛细管柱充分清洗并平衡。每次进样前依次用0.1 mol/L氢氧化钠、超纯水、运行缓冲液各冲洗3 min，以保证待测样品的重复性。

2.2 溶液的配制

2.2.1 运行缓冲液（空白溶液）的配制 称取十水合四硼酸钠380.0 mg，加100 ml超纯水溶解，摇匀，调pH至9.22，用0.22 μm滤膜过滤，即得40 mmol/L运行缓冲液。

2.2.2 样品缓冲液的配制 称取硼酸120.0 mg，加500 ml超纯水溶解，摇匀，调pH至6.97，用0.22 μm滤膜过滤，即得4 mmol/L样品缓冲液。

2.2.3 系列混合对照溶液的制备 称取呱仑酸钠对照品25.0 mg，置于50 ml量瓶中，加样品缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤。称取L-谷氨酰胺对照品332.5 mg，置于25 ml量瓶中，精密加入上述呱仑酸钠溶液2.0 ml，加样品缓冲液溶解并稀释至刻度，即得含13.30 mg/mlL-谷氨酰胺与40.0 μg/ml呱仑酸钠的混合对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液适量，加样品缓冲液逐级稀释至L-谷氨酰胺质量浓度分别为13.30、6.650、3.325、0.665 0、0.332 5 mg/ml，呱仑酸钠质量浓度分别为40.0、20.0、10.0、2.00、1.00 μg/ml的系列混合对照溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 分别称取批号为S49P、S56Q的2批L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒样品0.670 0 g，分别置于100 ml量瓶中，加样品缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤；精密量取5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加样品缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验

精密吸取空白溶剂（样品缓冲液）、3.325 mg/mlL-谷氨酰胺与10.0 μg/ml呱仑酸钠的混合对照品溶液和批号为S56Q的供试品溶液，分别注入毛细管电泳仪检测。色谱见图1。结果，L-谷氨酰胺对照品迁移时间为6.6 min，呱仑酸钠对照品迁移时间为7.9 min；空白溶液在相应位置未见色谱峰，不干扰L-谷氨酰胺和呱仑酸钠的测定。

2.4 线性范围考察

图1 毛细管电泳色谱图A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品（S56Q）溶液；1.L-谷氨酰胺；2.呱仑酸钠Fig 1 Capillary electrophoresis chromatogramsA.blank solution；B.mixed reference solution；C.test sample（S56Q）solution；1.L-glutamine；2.sodium gualenate

取L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的系列混合对照溶液适量，分别按“2.1”项下电泳条件进样，记录色谱峰，以质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得L-谷氨酰胺和呱仑酸钠的回归方程为y＝1.34×10－4x－0.12（r＝0.998 3），y＝8.26×10－4x+0.36（r＝0.999 3）。结果表明，L-谷氨酰胺和呱仑酸钠质量浓度分别在0.332 5～13.30、1.00～40.0 μg/ml范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.5 检测限和定量限

以信噪比为10计算最低定量限（LOQ），以信噪比为3计算最低检出限（LOD）。结果，L-谷氨酰胺的LOQ为66.50 μg/ml，LOD为33.25 μg/ml；呱仑酸钠的LOQ为1.00 μg/ml，LOD为0.500 μg/ml。

2.6 精密度试验

取含有5.50 mg/mlL-谷氨酰胺与16.0 μg/ml呱仑酸钠的混合对照品溶液，按“2.1”项下电泳条件，连续进样5次，记录峰面积。结果，L-谷氨酰胺峰面积的RSD为2.53%（n＝5），呱仑酸钠峰面积的RSD为1.55%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取同一批样品（批号：S49P）适量，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下电泳条件进样，记录峰面积。结果，L-谷氨酰胺峰面积的RSD为2.83%（n＝5），呱仑酸钠峰面积的RSD为1.73%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取“2.2.4”项下供试品溶液5.0 ml（批号：S49P）共9份，置于10 ml量瓶中，分别加入质量浓度为5.50 mg/ml的L-谷氨酰胺与16.0 μg/ml的呱仑酸钠混合对照品溶液各1.8、3.0、4.2 ml，加样品缓冲液稀释至刻度，摇匀，每个质量浓度平行3份。按“2.1”项下电泳条件进样，计算加样回收率，结果详见表1。

2.9 样品含量测定

取2批供试品（批号：S49P、S56Q），按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下电泳条件，分别进样测定，按外标法计算2批样品中L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的含量。结果，批号为S49P的供试品中含L-谷氨酰胺占标示量的100.3%，含呱仑酸钠占标示量的100.0%；批号为S56Q的供试品中含L-谷氨酰胺占标示量的103.2%，含呱仑酸钠占标示量的109.0%。该结果与按进口注册标准方法检测所得结果基本一致。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 The result of recovery test（n＝9）

3 讨论

3.1 检测方法的选择

L-谷氨酰胺和呱仑酸钠在水溶液中分别带正电荷和负电荷，两者极性均较大，难以用传统的RP-HPLC法进行分离。本文采用毛细管电泳法，依靠电泳和电渗两种作用，利用40 mmol/L硼砂缓冲液（pH＝9.22），使极性相反的L-谷氨酰胺和呱仑酸钠得到了良好的分离和检测。

3.2 检测波长的选择

呱仑酸钠在246、293、370 nm波长处均有最大特征吸收峰，通常选择290 nm作为其检测波长[7]，但L-谷氨酰胺在此波长下无紫外吸收。为了满足呱仑酸钠与L-谷氨酰胺的同时测定，故选择较低的220 nm波长作为本研究的检测波长，保证了二者响应良好，实现了L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的同时检测。

3.3 运行缓冲液pH的选择

硼酸盐缓冲液因pH缓冲范围较宽、紫外吸收较低而成为毛细管电泳试验中较常用的分离缓冲体系。本试验结合L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的pKa值对运行缓冲液浓度及其pH进行选择和优化。最终，选择40 mmol/L硼砂缓冲液（pH＝9.22）作为本研究运行缓冲液。

3.4 样品缓冲液pH的选择

利用毛细管电泳检测时，要求样品缓冲液电导值≤运行缓冲液电导值，以促使电泳区带聚焦，获得良好峰形[13]。本试验利用4 mmol/L硼酸缓冲液（pH＝6.97）作为样品缓冲液，其浓度为运行缓冲液浓度的1/10。样品缓冲液电导值＜运行缓冲液电导值，可使待测物保持良好峰形；同时，能确保样品缓冲液pH与运行缓冲液pH保持一定的差异，以利于样品分离和检测。

3.5 分离电压的选择

分离电压可直接影响电渗流、迁移时间、灵敏度和分离度等因素[13-14]。本试验比较了10、15、20 kV分离电压对L-谷氨酰胺与呱仑酸钠分离度的影响。结果表明，随着分离电压的增大，L-谷氨酰胺与呱仑酸钠的迁移时间减小，同时L-谷氨酰胺峰展宽；当电压为15 kV时，2种成分具有良好的分离度、迁移时间较短，且基线平稳，峰形相对较好。因此，确定分离电压为15 kV。

综上所述，本文建立的毛细管电泳法操作简便、准确性高、专属性强，能够满足复方制剂中L-谷氨酰胺与呱仑酸钠含量的同时测定。

[1]陈红，白学敏，孙建枢，等.麦滋林-S口腔溃疡膜剂的研制及其质量控制[J].中国临床药学杂志，2006，15（2）：120.

[2]彭兴盛，叶晓霞.麦滋林颗粒剂中奥磺酸钠的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2005，36（6）：361.

[3]国家食品药品监督管理局.L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒进口注册标准：JX20030254[S].2003.

[4]佟爱东，李薇，廖燕玲，等.分光光度法测定麦滋林-S颗粒中水溶性奥的含量[J].药物分析杂志，1994，14（5）：55.

[5]张占辉，刘庆彬，薄海静，等.高效液相色谱法测定呱仑酸钠的含量及有关物质[J].药物分析杂志，2001，21（5）：339.

[6]Arnal JF，Münzel T，Venema RC，et al.Interactions between L-arginine and L-glutamine change endothelial NO production.An effect independent of NO synthase substrate availability[J].J Clin Invest，1995，95（6）：2 565.

[7]王霞，张伟国.发酵液中L-谷氨酰胺的定性定量测定[J].食品与生物技术学报，2008，27（6）：111.

[8]Kaneta T，Maeda H，Miyazaki M，et al.Determination of amino acids in urine by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection[J].J Chromatogr Sci，2008，46（8）：712.

[9]Van Loon LJ，Saris WH，Verhagen H，et al.Plasma insulin responses after ingestion of different amino acid or protein mixtures with carbohydrate[J].Am J Clin Nutr，2000，72（1）：96.

[10]张帆，罗域城.反相高效液相色谱法同时测定L-谷氨酰胺呱仑酸钠颗粒中L-谷氨酰胺和呱仑酸钠的含量[J].药物分析杂志，2010，30（8）：1 448.