窄谱中波紫外线对体外培养黑素细胞增殖及代谢影响研究

安彩霞，赵亚楠，李婷婷，王红娟，普雄明

（1.新疆医科大学，乌鲁木齐 830001；2.新疆维吾尔自治区人民医院，乌鲁木齐 830001）

临床研究表明, 窄谱中波紫外线（Narrow band ultraviolet B，NB-UVB）对于白癜风患者具有较好的临床疗效[1]。但其作用机制目前尚不完全清楚[2-3]，我们采用体外培养人的黑素细胞作为研究对象，对其进行NB-UVB 的照射，观察照射前后黑素细胞增殖和黑素合成功能的变化，以此探讨窄谱中波紫外线治疗白癜风的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 氨甲环酸粉剂：中国食品药品检定研究院；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin）：美国Gibco 公司；培养基（M1，M2）、CCK－8 试剂、TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）、L－D0PA（左旋多巴）：美国Sigma 公司；NB－UVB 紫外线治疗仪（9W）：飞利浦公司；倒置相差显微镜：日本Nikon；二氧化碳培养箱：上海力申科学仪器有限公司；全自动酶标仪：美国Bio-Rad 公司；

1.2 研究方法

1.2.1 正常人黑素细胞的培养 取正常人包皮皮肤，剪成碎块后以0.25%胰蛋白酶冷消化12～15 h，胎牛血清终止消化，离心并收集细胞，M1 培养基培养原代，待出现大量典型梭形黑素细胞后（约10 d），再行胰酶消化，离心收集黑素细胞，置于M2 培养基中，培养至3～4 代，选择对数生长期的黑素细胞进行实验。

1.2.2 黑素细胞增殖的测定 将传代细胞的浓度调整至5×104个/孔后加入96 孔培养板。24 h 细胞贴壁后用不同剂量的NB-UVB 照射（照射剂量根据照射时间分为0，20，40，60，80，100 s），设立非照射阴性对照组，每一处理因素设立4 个复孔，继续培养24 h。于结束前4 h，加入CCK-8 液50 μL/孔，置酶标仪490 nm 波长测吸收光光度值，细胞增殖率=（待筛物各浓度平均吸光度值-空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值-空白组平均吸光度值）×100%。

1.2.3 酪氨酸酶活性的测定 96 孔培养板加入细胞浓度为5×104个/孔的黑素细胞悬液，24 h 后用不同剂量的NB-UVB 照射，并设立对照组继续培养48 h。48 h 后弃去上清液，PBS 洗2 次，每孔加0.1%的TritonX-100 溶液100 μL，振荡15 min，使细胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA 溶液50 μL/孔，37 ℃反应过夜，于酶标仪490 nm 波长处行吸收光光度值测定，酪氨酸酶活性=酶标仪所测吸光度值/细胞增殖的吸光度值。

1.2.4 黑素含量的测定 6 孔培养板加入细胞浓度为2.5×105个/孔的黑素细胞悬液，24 h 后用不同剂量的NB-UVB 照射，并设立非照射阴性对照组继续培养72 h。72 h 后弃上清液，PBS 液冲洗，消化、离心并收集细胞，血细胞计数器进行细胞计数；然后PBS洗涤2 次，重新溶解于1 mol/L NaOH 500 μL；80 ℃水浴2 h，转移至96 孔板，设4 个复孔，每孔100 μL；置酶标仪于405 nm 波长测吸光度值，黑素合成量=各孔吸光度值/各孔细胞密度。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0 软件分析，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养的正常人黑素细胞 黑素细胞具有特殊的树突状结构，体外培养的黑素细胞多有2 个树突，呈梭形，见图1，胞体内可见黑素颗粒，实验前经多巴染色阳性，见图2，证实为黑素细胞。在倒置显微镜下观察发现经NB-UVB 照射后的黑素细胞胞体变肿胀，树突变短，细胞数目较未照射组明显减少。

图1 体外培养正常的黑素细胞（镜下×40）

图2 多巴染色的黑素细胞（镜下×40）

2.2 NB-UVB 照射对黑素细胞增殖的影响 NBUVB 照射对于体外培养的正常人黑素细胞增殖具有抑制作用，小剂量20 s 照射其抑制作用与对照比较无统计学意义，40 s 以上照射对黑素细胞增殖具有抑制作用且随着剂量增大抑制作用增强，差异有统计学意义（P＜0.05)，见表1，经直线相关分析显示，NB-UVB 照射剂量与黑素细胞的增殖具有相关性，相关系数r=0.784（P<0.05）。

表1 不同剂量NB-UVB 对黑素细胞增殖的影响

2.3 不同剂量NB-UVB 照射对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响 与对照组比较，NB-UVB 照射对于体外培养的正常人黑素细胞酪氨酸酶活性具有促进作用，见表2，当NB-UVB 增加到一定剂量后酪氨酸酶活性稳定在一定范围。

表2 不同剂量的NB-UVB 对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响

2.4 不同剂量NB-UVB 照射对正常人黑素细胞的黑素合成的影响 与对照组比较，只有40 s 剂量NB-UVB 照射对于体外培养的正常人黑素细胞黑素的合成具有促进作用，20 s 及60 s、100 s 均无明显作用，而80 s 则具有一定促进作用，差异无统计学意义，见表3。

表3 不同剂量NB-UVB 照射对正常人黑素细胞的黑素合成的影响

3 讨论

中波紫外线（UVB），波长为290～320 nm，是紫外线生物学活性中最活跃的部分，对于人体皮肤影响较大。窄谱中波紫外线是指波长在310 nm 左右的中波紫外线，由于其单一性强，能够透过真皮并能在不导致皮肤灼伤的情况下释放出更多的能量，因此得以广泛应用于皮肤病的治疗。临床研究证实窄谱中波紫外线对于白癜风患者的治疗疗效较好，可以有效促进色素生成[4-5]，但对于其作用机制尚不明确。从本实验结果可以看到，窄谱中波紫外线照射对于人培养纯黑素细胞增殖具有抑制作用，与对照组相比有统计学意义（P<0.05)，而且其抑制率与紫外线的剂量呈正相关，这或许提示NB-UVB 治疗白癜风的作用机制或与其他因素有关。我们分析这种对体外培养的黑素细胞增殖的抑制作用符合紫外线的特性，即NB-UVB 对黑素细胞产生了剂量依赖性杀伤效应，随着照射剂量的提高，细胞凋亡数量也逐渐增加[6]。目前较多的研究认为，若在体外以UVB 照射纯培养的黑素细胞，其数量将会减少[7-8]，仅有少数研究报道在黑素细胞与角质形成细胞共同培养的条件下经过UVB 照射后黑素细胞数量会增加[9]，这种结果的出现或与角质细胞的参与有关。

紫外线对于黑素细胞功能的影响，即对酪氨酸酶活性的影响和对黑素合成的影响目前报道也不尽相同[10-11]。Romero-Graille 等[12]报道，以7.2 mJ/cm2的UVB 照射体外与角质细胞混合培养的黑素细胞，可引起黑素细胞内黑素含量的上升，而其他剂量的UVB 未见对黑素合成有明显影响；Abdel-Naser[13]的实验也表明UVB 对体外纯的黑素细胞仅在小剂量时有促进黑素合成的作用，而随着辐射剂量的增加，对黑素合成未见明显影响，这与我们的实验结果很接近，我们也发现仅在40 s 剂量时对黑素合成有促进作用，这或许与紫外线照射能促进酪氨酸酶活性增加，而随着剂量增大，黑素细胞增殖又受到抑制有关，具体机制尚需进一步研究。而多项研究报道UVB 照射能促进黑素细胞的酪氨酸酶活性增加[14-15]。在本实验结果中，可以观察到不同剂量的窄谱中波紫外线对于黑素细胞的酪氨酸酶活性有不同程度的促进作用。这种促进作用并不随着剂量逐渐增加，当NB-UVB 增加到一定剂量后酪氨酸酶活性稳定在一定范围，这与之前的研究结果大致相符。曾有实验发现UVB 诱导产生的黑素细胞DNA 损伤片段可以激活酪氨酸酶的活性，从而促进黑素合成[16]，同时发现黑素细胞膜上具有紫外线（UV）受体，UV 是通过黑素细胞膜上的光受体激活第二信使系统中的磷脂酶C 和蛋白激酶C，最终出现ɑ-黑素细胞刺激素样（ɑ-melanocyte stimulating hormone，ɑ-MCH)作用[17]。由此可以解释在黑素细胞受到NB-UVB 照射，黑素细胞出现增殖抑制而同时会出现酪氨酸酶活性增强的现象，但这种细胞功能增强并不是随着照射剂量增加无限增强的，这也体现了紫外线对于黑素细胞生物学特性影响的复杂性，而在人体内，这一过程可能会有更多细胞因子等调节因素的参与，因此，尚需进一步实验去研究和探讨窄谱中波紫外线治疗白癜风的可能机制。

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