黄芪注射液穴位注射对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤的干预性研究

翟慧娟，朱明明

（河南省新乡市新乡医学院第三附属医院，新乡453003）

皮肤的衰老见于多种疾病，也与自然的生理过程和非自然的因素有关，预防和延缓皮肤衰老一直是医学界研究的焦点。运用祖国的传统医学治疗衰老也备受临床各科的青睐[1-2]。目前中药注射液穴位注射抗衰老的研究却鲜有报道，本文在制备小鼠衰老模型的基础上，应用黄芪注射液足三里穴位注射法，观察小鼠血液与皮肤中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及羟脯氨酸（Hydroproline，HYP）含量的变化，探讨黄芪穴位注射在延缓皮肤衰老过程中的抗氧化干预作用，以期为临床预防皮肤衰老提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级BALB/c-nu/nu 小鼠，雌性，体质量20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号0066091，动物许可证号：SCXK（京）2007-0001，标准饲料饲养。

1.1.2 主要器材 Biofugel5R 低温离心机；UV-1700 分光光度计；DY89-1 匀浆器；WH-861 涡旋混匀器型号（WH－861）；JA-1003 电子分析天平。

1.1.3 主要试剂 SOD、MDA、HYP 测定试剂盒，均购自南京建成生物工程公司。黄芪注射液由石家庄神威药业有限公司生产，国药准字Z13020999。D-半乳糖（D－galactose）系上海化学试剂二厂生产。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将40 只小鼠随机分为模型组、黄芪组、生理盐水组和对照组，每组10 只。前3组小鼠于背部正中线两侧处用脱毛膏脱毛，面积约1.5 cm×1.5 cm 大小, 然后生理盐水清洗。参照文献[3]制备D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型：每天于小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg），连续注射42 d。在造模21 d 后，黄芪组于小鼠足三里穴位注射黄芪注射液,每侧穴位各注射0.01 mL[4-5]；生理盐水组在同样穴位注射等量生理盐水；模型组和对照组不进行穴位注射。注射过程均按无菌操作进行，连续注射21 d 后处死动物，取材备用。

1.2.2 动物取血 实验结束时腹主动脉采血，每只取3～5 mL，放置10 min 后离心（3 000 转/min，10 min）。移取血浆1 mL 备用样品,按照试剂盒说明书测定小鼠血浆SOD 活性和血浆MDA 及HYP 含量，SOD 采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA 和HYP 采用硫代巴比妥法测定。

1.2.3 制备皮肤组织匀浆 动物处死前1 d 脱毛，用10%Na2S 溶液涂于每组小鼠两肩胛至两髂骨之间背部皮肤，第2 天按3.5 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后剪下动物背部脱毛后的皮肤，铺平后打孔器对称取下4 块皮肤，每块直径约1.4 cm左右，预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和结缔组织，眼科小剪剪碎组织块，倒入匀浆管中，用电动玻璃匀浆机，在冰水中进行操作，要反复冻融3 次，使细胞内容物完全游离于液相之中，用冰冻生理盐水制成10%的组织浆液，置于-70 ℃冰箱备用。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件进行资料数据分析，各组间比较采用t 检验，若各组方差不齐时，用Dunnett′s C 法做两两比较，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠血清中SOD 活性以及MDA 和HYP含量变化 见表1。

表1 小鼠血清中SOD 活性与HYP 和MDA 含量的变化比较 （n＝10,x±s）

2.2 4 组小鼠皮肤组织中SOD 活性以及MDA 和HYP 含量变化 见表2。

表2 小鼠皮肤SOD 活性以及MDA 和HYP 的含量变化（n＝10,x±s）

从表1、2 中可以看出：血清与皮肤组织中的变化基本一致，模型组小鼠血清与皮肤组织中SOD 活性和HYP 含量明显低于对照组（P＜0．01）；MDA 明显高于对照组（P＜0．01）；黄芪组小鼠血清与皮肤组织中SOD 活性和HYP 含量明显高于模型组（P＜0．01）；MDA 明显低于模型组（P＜0．01）。生理盐水组小鼠血清与皮肤组织中SOD 活性和HYP 含量明显高于模型组（P＜0．05）；MDA 明显低于模型组（P＜0．05）。

3 讨论

衰老与抗衰老一直是当今医学界讨论与研究的热点问题之一，探求有效的抗衰老中药也是一个重要的医学课题。黄芪为豆科植物膜荚黄芪，具有抗衰老、抑制细胞过度凋亡[6]，提高机体免疫力、抗氧化和清除自由基[7]的作用。机体的衰老与自由基有着密切关系，随着年龄的增长，机体抗氧化酶活性逐渐下降，使自由基不能完全被清除，其机体的损伤作用不断积累，进而引起皮肤衰老[8]。SOD 可以消除体内自由基，使机体免受损伤，如果体内SOD减少，就会导致自由基增多，并攻击细胞膜不饱和脂肪酸，使其氧化和过氧化形成MDA，后者通过链式反应引起细胞的代谢障碍，最终死亡。因此SOD反映了体内自由基的清除情况，MDA 反映了体内细胞的受损程度。SOD、MDA 与机体的抗氧化能力及自由基的清除密切相关[9]。黄芪注射液穴位注射能否延缓皮肤的衰老？笔者建立了小鼠衰老模型并进行了该方面的研究，结果发现：黄芪组与模型组比较皮肤中SOD 的活性和HYP 的含量均明显增加，MDA 明显降低。

HYP 是一种主要存在于胶原纤维和胶原蛋白中的非必需氨基酸，其含量相对恒定，是检测机体胶原代谢的重要指标[10]。HYP 的含量可以间接反映出真皮内胶原蛋白含量的变化[11]，也是衡量皮肤衰老的指标之一，HYP 的减少是皮肤老化的主要表现[12-13]。本研究中黄芪组小鼠血液中的SOD、MDA 和HYP变化与皮肤改变趋势一致，推测黄芪注射液加上穴位注射具有延缓皮肤衰老的作用，其机制可能是增强了机体免疫功能，提升了抗氧化能力，清除了体内过剩的自由基[14]。这为祖国的中医中药在治疗皮肤衰老的应用上又提供了新的佐证和科学依据。

同样本实验也发现，生理盐水组小鼠血清和皮肤组织中SOD 活性及HYP 含量较模型组明显增高，同时MDA 含量明显下降。这一现象提示足三里的针刺作用同样也可以延缓皮肤的衰老过程，就其功能而论较黄芪略显逊色。

笔者采用D-半乳糖（D－galactose）制作小鼠衰老模型，针刺加黄芪注射液注入足三里穴位，有效地提升了皮肤中SOD 活性和HYD 含量，也即增加了皮肤的抗氧化能力，同时反映出皮肤的结缔组织中胶原蛋白代谢减缓，合成增加，延缓了皮肤的衰

老[15]。

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