老年患者银屑病性关节炎T辅助细胞17/调节性T细胞及相关细胞因子的检测

吴浩浪，陈晋广

（1.南方医科大学附属小榄医院，中山 528415；2.广东省中山市人民医院，中山 528403）

近年来随着对Th17 细胞研究的深入，Th17/Treg 细胞在多种自身免疫性疾病中的发病作用成为研究热点,改变了以往对某些自身免疫性疾病发病机制的认识。早期Kunihara 等[1]研究报道，Th17、Treg 异常表达在RA、幼年特发性关节炎等多种炎性关节病中起到重要作用, 而且与患者病情等紧密相关。笔者通过对老年患者银屑病性关节炎Th17、Treg 细胞表达及相关细胞因子白细胞介素17（IL-17）、血清人转化生长因子-β1（TGF-β1）水平进行检测,探讨在银屑病性关节炎发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 近5 年来本院风湿免疫科、皮肤科的银屑病性关节炎患者36 例。其中男19 例,女17例，年龄59～78 岁,病程3 年～16.5 年。所有研究对象均无心脑血管、肝、肾、内分泌等其他严重系统性疾病，同时近半个月未应用过免疫调节剂及糖皮质激素等药物系统治疗。30 例正常对照组来自病人家属或陪护人，其中男18 例,女12 例，年龄61～75 岁，均无严重系统性疾病及其他自身免疫病。2 组研究对象的性别、年龄差异无统计学意义。研究对象签订知情同意书。

1.2 IL-17、TGF-β1 检测 清晨抽取空腹外周静脉血5 mL 肝素抗凝，ELISA 法（ELISA 试剂盒，美国R＆D 公司）检测TGF-β1、IL-17 表达水平,严格按照试剂盒说明进行。每个样本和标准品均设3 个复孔,在波长为450 nm 下用酶标仪读数。

1.3 Th17 和CD4+CD25+Treg 亚群检测 空腹抽取外周静脉血5 mL，Ficoll 密度梯度法分离淋巴细胞，PBS 冲洗（含1%小牛血清）,制备淋巴细胞悬液（浓度1×109/L）,48 孔培养板,每孔1 mL,加50 μg/L 佛波酯、1 mg/L 离子霉素和2 μmol/L 莫能菌素, 在孵箱（37 ℃、5%CO2）中培养5 h。收集细胞分为对照管和实验管, 加入20 μL 鼠抗人CD4 单抗（PE-Cy5 标记，美国R＆D 公司），混匀,避光放置20 min（室温）对表面抗原染色。加Cytofix/Cytoperm 液200 μL，放置20 min（4 ℃）,通透和固定细胞,洗涤。实验管加入鼠抗人CD25 抗体（FITC 标记）和IL-17 抗体（FITC标记）各10 μL，对照管加入同型对照抗体,避光孵育30 min（4 ℃）,用Perm/Wash 液1 mL 洗涤2 次,以300 μL 洗涤液重悬细胞流式细胞仪检测。以CD4直方图设门区分Th 细胞（CD4+）,以散点图IL-17、CD25阳性表示Th17和Treg,Cellsquest 软件分析数据。

2 结果

Th17 细胞在银屑病性关节炎患者外周血中表达显著高于对照组（u=3.60，P＜0.05），2 组Treg 细胞的表达差异无统计学意义（u=0.98，P＞0.05）；银屑病性关节炎患者Th17/Treg 也显著高于对照组（u=4.07，P＜0.05）。IL-17 在银屑病性关节炎患者外周血中水平高于对照组（t=3.41，P＜0.05），TGF-β1 表达水平显著低于对照组（t=4.40，P＜0.05）。见表1。

表1 2 组Th17/Treg、IL-17、TGF-β1 表达比较 （±s）

表1 2 组Th17/Treg、IL-17、TGF-β1 表达比较 （±s）

TGF-β1（pg/mL）银屑病性关节炎组组别 n Th17（%）Treg（%）Th17/Treg IL-17（pg/mL）36 15.40±1.70 6.10±1.22 3.01±0.50 421.44±151.10 179.41±98.20对照组 30 8.42±1.37 5.91±1.20 1.81±0.17 251.67±119.24 231.47±109.91

3 讨论

银屑病性关节炎是一种累及多关节和结缔组织的慢性炎症性、免疫性疾病，研究显示，高达40%～57%患者有破坏性畸形关节炎，17%患者可出现5个或更多关节畸形，11%～19%导致残疾[2]，严重影响患者的健康。Treg、Th17 分化失衡参与了多种炎症反应性疾病和自身免疫性疾病发病[3]。Kunihara 等[1]研究报道，Th17/Treg 细胞亚群失衡参与了RA、幼年特发性关节炎等多种炎性关节病的发病，与病情活动度相关。银屑病是一种T 淋巴细胞介导并维持的累及皮肤及关节损害的自身免疫性疾病，亦存在Th17的异常活化[4]。Treg 可通过抑制性细胞因子TGF-β1、细胞接触机制等发挥主动免疫抑制效应，可选择性抑制某些效应性T 细胞和某些自身反应性T 细胞活化，在机体免疫耐受的调节中发挥重要的作用[5]。

本研究显示，Th17 细胞在PsA 患者外周血中表达明显高于正常人群（P＜0.05），而Treg 表达无显著性变化（P＞0.05）；从而导致患者Th17/Treg 升高现象。除了分泌IL-17 外，Th17 细胞还可以促进内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等产生IL-6，IL-6 转而又能剂量依赖性促进IL-17 的分泌,这种正反馈作用进一步促进患者IL-17 高表达。当机体TGF-β1水平低下时，初始型T 细胞向Treg 的分化将减弱，Treg 不能随Th17 升高而相应上升，从而出现Th17/Treg 失调。Th17 表达的破骨细胞分化因子与破骨细胞前体上的NF-κB 的受体激活剂结合，导致破骨前体细胞分化为破骨细胞[6]。TGF-β1 在骨髓成骨祖细胞分化、增殖中起到重要作用，银屑病性关节炎患者TGF-β1 表达降低势必影响病人骨形成以及骨关节修复，与杨雁等[7]研究结论一致。Th17/Treg 的漂移以及相关细胞因子的变化反映了银屑病性关节炎整个复杂免疫反应异常的又一个重要环节,为今后银屑病性关节炎免疫学发病机制的研究提供新思路。

[1] Kunihara T, Sasaki S, Nishibe T, et al. Successful endovascular stent -grafting for thoracic aortic aneurysms in systemic lupus erithematosus. Report of 2 cases and review of the literature[J]. J Cardiovasc Surg（Torino）,2002,43:235-240.

[2] 吴东海，王国春．实用临床风湿病学[M].北京：中国医药科技出版社,2001：306．

[3] Nakatsukasa H, Tsukimoto M, Tokunaga A, et al. Repeated gamma irradiation attenuates collagen-induced arthritis via up-regulation of regulatory T cells but not by damaging lymphocytes directly[J].Radiat Res,2010,174:313-324.

[4] 陈晋广，杨志波.“血分论治”治疗寻常性银屑病患者外周血IL-17 和IL-23 的变化[J].中华皮肤科杂志,2012,45（2）:140-141.

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[6] Sato K, Suematsu A, Okamoto K, et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction[J].J Exp Med,2006,203:2 673-2 682．

[7] 杨雁,杨静,段西凌,等.银屑病性关节炎患者血清中转化生长因子-β1 的检测[J].中华皮肤科杂志,2011,44（7）:513-514.