白斑颗粒Ⅰ号方对白癜风患者Foxp3 mRNA表达的影响

张峻岭，王琳，赵俊芳，张丹丹，刘晓洁

（1.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；2.天津市第五中心医院，天津 300450；3.天津市河西区妇产医院，天津 300202）

白癜风是一种常见的由于黑素细胞特发性损害而致的后天性色素脱失性皮肤病，发病率约为0.1%～2%[1]，近年有逐渐增高趋势。白癜风的病因尚不明确，近年来的大量研究支持了白癜风是一种自身免疫相关性疾病。白斑颗粒Ⅰ号方作为院内制剂治疗气滞血瘀型白癜风应用30 余年，取得了满意的临床效果，但具体作用机制不明，早有研究证实某些中药可以调节机体的免疫功能。本研究通过观察白斑颗粒Ⅰ号方对白癜风患者外周血单核细胞（PBMC）Foxp3mRNA 表达的影响，来探讨白斑颗粒Ⅰ号方对白癜风患者的免疫调节作用，以助于揭示白斑Ⅰ号方可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 病例来源 收集本院皮肤科普通门诊及色素性皮肤病专病门诊的寻常型进展期白癜风患者60例，中医证型均为气滞血瘀证，随机分为2 组，试验组30 例，男17 例，女13 例，平均年龄（27.93±15.31）岁，平均病程（23.46±51.36）个月；对照组30例，男14 例，女16 例，平均年龄（33.56±20.52）岁，平均病程（20.18±40.97）个月；健康对照组30 例，男15 例，女15 例，平均年龄（30.45±18.32）岁；试验组与对照组在性别、年龄和病程上差异均无统计学意义（P>0.05）；中医诊断标准参照《中华人民共和国中医药行业标准——白驳风诊断依据、证候分类、疗效评定》[2]；西医诊断标准参照赵辨《中国临床皮肤病学》中白癜风诊断标准；分型分期参照中国中西医结合皮肤性病学会色素病学组有关白癜风临床分型及疗效标准（2003 年修订稿）[3]。

1.2 中药制剂和仪器 本院院内制剂白斑颗粒Ⅰ号方（津药制字Z20070008）；RG-3000 荧光定量PCR 仪（澳大利亚Corbett Research 公司）；、Trizol 试剂(天津润泰科技发展有限公司）、引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒，RealMasterMix（SYBR Green I）试剂盒，DNA Marker 均购自天津博敏达生物科技有限公司。

1.3 分组及给药方法 气滞血瘀型白癜风患者随机分为2 组，试验组30 例，给予口服白斑颗粒Ⅰ号方3 g，2 次/d，转移因子胶囊（成都利尔药业有限公司）6 mg，2 次/d，外用糠酸莫米松（面部除外），1 次/d，或0.1%他克莫司（面部），2 次/d，治疗3 个月；对照组30 例，转移因子胶囊6 mg，2 次/d，单纯外用糠酸莫米松（面部除外），1 次/d，或0.1%他克莫司（面部），2 次/d，疗程3 个月。

1.4 方法

1.4.1 分离PBMC 取试验组、对照组治疗前、后及健康对照组肝素抗凝外周血5 mL，PBS 稀释，淋巴细胞分离液（Ficoll）分离出单个核细胞，调细胞至1×109/L。

1.4.2 样本总RNA 提取及cDNA 的合成 按TRIzol 试剂产品说明书进行单核细胞（MNCs）总RNA 提取，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 的质量，逆转录合成cDNA，逆转录步骤按照Transcript cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行，吸光度扫描计算总RNA 浓度。

1.4.3 实时荧光定量PCR 反应检测Foxp3 mRNA表达水平 参照文献[4]设计引物，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，Foxp3 引物序列如下：上游：5′-gCTgggAAAATggCACTgAC-3′，下游：5′-gTT TCCATggCTACCCCACA-3′，预计产物长度443 bp；内 参GAPDH 序 列 上 游：5′-CACCATCTTCCAgg AgCgAg-3′，下游：5′-AAATgAgCCCCAGgCCTTCTC-3′，预计产物长度261 bp。反应条件为95 ℃变性10 s、62 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，50 个循环。应用RG-3000 荧光定量PCR 仪（澳大利亚Corbett Research Sydney 公司）实时监测整个PCR 进程。Foxp3mRNA 表达相对表达量采用2-△△Ct法处理数据[4]。

1.5 统计学方法 计量资料呈正态分布分别以均数±标准差（x±s）表示。2 组样本间均数的比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。所有数据运用SPSS17.0 进行统计。

2 结果

2.1 白癜风患者组与健康对照组PBMC 中Foxp3 mRNA 表达量的比较 白癜风患者组（n=60）与健康对照组（n=30），Foxp3 mRNA（2-△△CT）表达量分别为（0.380±0.027）和1，2 组差异有统计学意义（t=33.77，P<0.05）。

2.2 试验组与对照组治疗前后Foxp3 mRNA 的表达量的比较

2.2.1 试验组治疗3 个月后Foxp3 mRNA 的表达量高于治疗前的Foxp3 mRNA 的表达量，差异有统计学意义（t=39.71，P<0.05）。见表1。

2.2.2 对照组治疗3 个月后Foxp3 mRNA 的表达量高于治疗前的Foxp3 mRNA 的表达量，差异有统计学意义（t=54.79，P<0.05）。

2.2.3 治疗3 个月后，试验组治疗前后外周血Foxp3 mRNA 的表达升高值高于对照组治疗前后外周血Foxp3 mRNA 的表达升高值，差异有统计学意义（t=13.26，P<0.05）。

表1 治疗前、后Foxp3 mRNA(2-△△Ct)表达量比较 （x±s）

3 讨论

Foxp3 称叉状头/翅膀状螺旋转录因子，属于转录因子forkhead/winged-helix 家族，是调节性T 细胞发育和功能维持的关键转录因子，是Treg 细胞的特征性标志，对Treg 的发育和功能起着关键作用，编码转录抑制因子Foxp3[6]。最近的研究发现转录因子Foxp3 特异性高表达在胸腺和外周CD4+CD25+调节T 细胞表面，CD4+CD25+Treg 细胞的活化同时伴有细胞中Foxp3 表达的增加，其表达水平与CD4+CD25+Treg 细胞的抑制活性有关[7]。Foxp3 的缺乏可以损害自我耐受和免疫调节功能，导致严重的自身免疫性疾病[8]。

白癜风患者CD4+CD25+Treg 细胞数量的减少或功能的缺陷，CD4+CD25+Treg 细胞数量的减少，同时伴有细胞内Foxp3 表达的降低，Foxp3 的异常与细胞的抑制功能异常有关，提示与白癜风CD4+CD25+T细胞的功能异常和发病机制密切相关[9]。这在一定程度上导致其免疫抑制功能受损，使自身反应性T细胞激活，同时B 细胞活化、增殖、产生抗黑素细胞抗体，机体的细胞免疫和体液免疫功能紊乱，促进了黑素细胞的破坏，这可能为白癜风一种可能的发病机制。本研究表明，寻常型进展期白癜风患者与健康对照组比较PBMC Foxp3 mRNA 表达量显著下降。白癜风患者由于处于免疫失衡状态，细胞免疫尤其是Treg 细胞可能参与了白癜风的发病。

白斑颗粒Ⅰ号方为著名中西医结合皮肤病学专家边天羽教授根据经典方剂“通窍活血汤”加减化裁而来，成为院内制剂（津药制字Z20070008），临床应用多年，用于气滞血瘀证的患者，联合外用激素治疗，取得满意效果，可有效控制白癜风的发展，提高疗效，缩短外用激素时间，减少激素不良反应。方中主要有红花、防风、桃仁、大枣、川芎、生姜、葱白、赤芍、补骨脂、白芷组成，具有补益脾肾、行气活血、祛风通络的功效。方中补骨脂补益脾肾，取肾为先天之本肾藏精，脾为后天之本气血生化之源，脾肾同补，精血互生。川芎、赤芍共用行气活血，桃仁、红花活血通络，葱姜通阳，防风、白芷祛风，又兼走表，直接作用于发病部位，佐以大枣益气和中。

本研究探讨Foxp3 基因白癜风患者治疗前后差异表达发现，寻常型进展期白癜风患者与健康对照组比较PBMC Foxp3 mRNA 显著下降。白癜风试验组治疗后患者PBMC 中Foxp3 mRNA 水平显著升高，接近正常水平，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,说明经过有效治疗，随着CD4+CD25+Treg细胞Foxp3 mRNA 表达水平的升高，白癜风患者CD4+CD25+Treg 细胞的免疫调节功能得到恢复，抑制自身反应性T 细胞活性和功能加强，使患者的病情得到缓解。说明白斑颗粒Ⅰ号方可以通过纠正患者的调节T 细胞功能，使Foxp3 转录因子水平恢复或接近正常水平，达到调节免疫功能的作用，起到治疗白癜风的目的。

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