抑制SUMO特异性蛋白酶1在小鼠急性肺损伤中的保护作用

马禕文　吕翔

(上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科， 上海　200011)

·论著·

抑制SUMO特异性蛋白酶1在小鼠急性肺损伤中的保护作用

马禕文吕翔

(上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科， 上海200011)

摘要目的：探讨抑制SUMO特异性蛋白酶1/低氧诱导因子-1α (SUMO-specific protease 1/hypoxia-inducible factor-1α，SENP1/HIF-1α)信号通路在减轻脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性肺损伤中的作用及机制。方法： 建立小鼠LPS致急性肺损伤模型，采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法检测小鼠经LPS处理后肺组织中SENP1 mRNA的表达，采用蛋白质印迹(Western 印迹)法检测HIF-1α蛋白的表达。采用小干扰RNA法敲除小鼠淋巴瘤巨噬细胞(RAW264.7)SENP1的表达，用LPS处理对照组和干扰组细胞后，采用Western 印迹法检测细胞中caspase-3、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达，采用酶联免疫吸附试验法检测细胞中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。结果： 小鼠急性肺损伤后肺组织中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA的表达水平均升高。经LPS处理后，干扰组caspase-3、iNOS和MPO较对照组均显著降低(P<0.05)。结论： 抑制SENP1/HIF-1α通路可减轻LPS致小鼠急性肺损伤。

关键词SUMO特异性蛋白酶1；低氧诱导因子-1α；急性肺损伤

Protective Effect Associated with Inhibiting SUMO Specific Protease 1 for Acute Lung Injury in MiceMAYiwenLÜXiangDepartmentofAnesthesiology,TheNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective： To explore the effect and mechanism of inhibiting SUMO-specific protease 1/hypoxia-inducible factor-1α (SENP1/HIF-1α) pathway for attenuating acute lung injury induced by lipopolysaccharide(LPS) in mice. Methods： LPS induced acute lung injury model in mice was established. The expression of SENP1 mRNA in lung tissue of mice treated by LPS was tested by Real-Time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), while the expression of HIF-1α protein was tested by Western blotting.Small interfering RNA (siRNA) was used to knock out the expression of SENP1 of mouse leukemic monocyte macrophage cell (RAW 264.7). Once the cells from both control group (Ns group) and interfering group (Si group) were treated by LPS, the expression of caspase-3,inducible nitric oxide synthase(iNOS) was detected by Western blotting and the activity of myeloperoxidase(MPO) was tested by PCR. Results： The expression levels of both HIF-1α protein and SENP1 mRNA increased in lung tissue of mice after acute lung injury.The levels of caspase-3, iNOS and MPO significantly decreased in Si group after the treatment by LPS, compared with that in Ns group (P<0.05). Conclusions： Inhibition of SENP1/HIF-1α pathway may attenuate acute lung injury induced by LPS in mice.

Key WordsSUMO-specific protease 1；Hypoxia-inducible factor-1α；Acute lung injury

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是在多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)中最早发生的器官损伤，也是MODS在肺内的表现，ALI严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，而且一旦发展为ARDS，病死率可超过41.1%[1]。因此，针对ALI的临床研究和基础研究一直是热点和难点。

SUMO特异性蛋白酶家族(SUMO-specific proteases，SENPs)在哺乳动物细胞中有6个成员，目前研究较多的是SENP1。有研究[2-3]证实，SENP1通过去SUMO化使低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)稳定表达，且SENP1为HIF-1α稳定表达所必须[3-5]。另有研究[6]发现，ALI与肺内持续激活的HIF-1α表达关系密切。本研究探讨了抑制SENP1/HIF-1α通路在ALI中可能的保护作用。

1资料与方法

1.1实验动物12周龄雄性C57野生型小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司，C57BL/6Slac)18只，体质量(25±1.15) g，以标准饲料适应性喂养3 d，均按SPF级动物饲养，24 h通风，室温控制在(23±2)℃。

1.2细胞及主要试剂小鼠淋巴瘤巨噬细胞：RAW264.7(中国科学院细胞库)。主要试剂：二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、Triton X-100、NP-40；TRIzol、脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；DMEM培养基与0.25%胰酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；HIF-1α抗体(美国Novus公司)；诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOs)及cleaved caspase-3抗体(美国CST公司)；反转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；SYBR Green PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)。

1.3方法

1.3.1小鼠ALI模型的建立、标本收集及指标检测C57小鼠随机分为对照组和ALI组，各9只。对照组小鼠尾静脉注射0.9%氯化钠液，ALI组尾静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，7.5 mg/kg)。于尾静脉注射24 h后两组均腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后开胸取肺组织。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法检测小鼠肺组织SENP1 mRNA的表达[ 所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成]。小鼠SENP1上游引物：5′-AGCTGCCCAAGAAACCAGGAAA-3′，下游引物：5′-AATGGTCAAGCGGAATGCCT-3′；采用蛋白质印迹(Western 印迹)法检测小鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达。

1.3.2细胞干扰及凋亡指标检测采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)法干扰小鼠淋巴瘤巨噬细胞(RAW264.7) SENP1的表达，将针对小鼠SENP1的siRNA-GTGAACCACA-ACTCCGTATTC(由上海吉玛公司合成)引入小鼠RAW264.7，并采用Real-Time PCR法检测SENP1 mRNA敲除效率。细胞SENP1引物序列(上游引物：5′-AGTGAAACGCTGGACAAA-3′，下游引物：5′-CCTGGGCTTTGGTTTGGA-3′)。将RAW 264.7细胞株分为4组，非特异性干扰(Ns)和特异性干扰(Si)各2组。2个Ns组和2个Si组中，各有1组用LPS(1 mg/mL)进行处理(设为LPS处理组)，未经LPS处理的细胞为对照组。LPS处理24 h后，采用Western 印迹法检测细胞中caspase-3和iNOS的表达，采用酶联免疫吸附试验法检测细胞的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。

1.4统计学处理采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1LPS致小鼠ALI后对肺组织中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA表达的影响Western 印迹和Real-Time PCR结果发现，ALI组小鼠肺组织中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA表达较对照组升高，见图1~2。

图1　LPS致C57小鼠ALI后肺组织中HIF-1α蛋白的表达

与对照组比较，*P<0.05

2.2细胞干扰及凋亡指标检测结果Real-Time PCR结果显示，RAW 264.7细胞的SENP1基因敲除效率为(0.64 ± 0.19)%，见图3。在LPS处理后，Western 印迹结果显示，Ns组细胞和Si组细胞HIF-1α蛋白表达水平均上升，但Si组细胞中HIF-1α蛋白表达水平明显低于Ns组细胞(P<0.05)，见图4。LPS处理后，Western 印迹结果显示，Si组细胞中下游凋亡基因caspase-3和炎性指标iNOS蛋白表达水平显著低于Ns组细胞(P<0.05)，见图4。LPS处理后，Si组细胞中MPO活性显著低于Ns组细胞(P<0.05)，见图5。

与对照组比较，*P<0.05

图4　Ns组和Si组细胞经LPS处理后细胞中

与对照组比较，*P<0.05

3讨论

目前针对ALI的主要治疗手段仍然是支持治疗，而支持治疗主要是呼吸机机械通气，未从本质上改变其病理生理过程。ARDS的病死率达50%，严重威胁着创伤患者的生命[7]，并且ALI/ARDS的发生大大增加了患者的住院时间和医疗费用[8]。由此可见，寻找治疗ALI的新方法尤为迫切。HIF-1α是细胞低氧或缺氧条件下的产物，越来越多的研究证明，它与炎性反应有密切的关系。有研究[6]证实，ALI时，肺组织中HIF-1α的表达水平明显升高，而HIF-1α抑制剂可使ALI明显减轻。本研究中，利用LPS诱导的小鼠ALI中，HIF-1α蛋白、SENP1 mRNA的表达水平均明显升高。此外，鉴于SENP1是稳定HIF-1α的重要蛋白酶，本研究通过敲除细胞株中的SENP1证实，SENP1敲除细胞经LPS诱导后，HIF-1α蛋白表达水平及其下游基因caspase-3、iNOS蛋白的表达水平均较经LPS处理的野生型细胞下调，MPO活性减小，说明抑制SENP1/HIF-1α信号通路可以减轻ALI。在ALI研究中，一般以HIF-1α下游的信号通路多见，而本研究发现其上游信号分子SENP1通过对HIF-1α的去SUMO化反应而在ALI中发挥作用，这为靶向基因治疗提供了新视角、新方法。

参考文献

[ 1 ]von Dossow-Hanfstingl V.Advances in therapy for acute lung injury[J].Anesthesiol Clin, 2012,30(4):629-639.

[ 2 ]Xu Y,Zuo Y,Zhang H,et al.Induction of SENP1 in endothelial cells contributes to hypoxia-driven VEGF expression and angiogenesis[J].J Biol Chem,2010,285(47):36682-36688.

[ 3 ]Cheng J,Kang X,Zhang S,et al.SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIF1alpha during hypoxia[J].Cell,2007,131(3):584-595.

[ 4 ]程金科.SUMO蛋白酶1与肿瘤[J].癌症,2008,27(7):771-774.

[ 5 ]程金科,左勇.去SUMO化蛋白酶的生物学功能与作用基础研究[J].上海交通大学学报：医学版, 2012,32(9):1117-1121.

[ 6 ]Jiang H,Huang Y,Xu H,et al.Inhibition of hypoxia inducible factor-1α ameliorates lung injury induced by trauma and hemorrhagic shock in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(5):635-643.

[ 7 ]Garcia A.Critical care issues in the early management of severe trauma[J]. Surg Clin North Am,2006,86(6):1359-1387.

[ 8 ]Treggiari MM,Hudson LD,Martin DP,et al.Effect of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome on outcome in critically ill trauma patients[J].Crit Care Med,2004,32(2):327-331.

中图分类号R563

文献标识码A

通讯作者吕翔， E-mail：lvxiang1980@163.com