环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌

庞心怡 ，满朝新，赵玥明，周文琦，闫天文，柴云雷，韩建春，姜毓君，

(1东北农业大学食品学院/乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030;2 东北农业大学国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086)

沙门氏菌(Salmonella)在环境中广泛存在，是一种引起食源性疾病的重要致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状［1］。最近的一项美国食源性疾病暴发的报告中指出，沙门氏菌是最常见的细菌性病原体，占所有细菌性食物中毒的52%［2］。近年来在我国，沙门氏菌也是微生物引起食源性疾病中最主要的病原菌之一，占17.19%［3］。沙门氏菌菌属类型多样，抗原复杂，目前已分离出2 500 多个血清型。许多动物性食品都是沙门氏菌污染的主要来源，其中肉类更为常见［4］。目前检测沙门氏菌的传统方法费时费力，PCR 为代表的分子生物学方法需要昂贵仪器和复杂设备，不能达到现代检测对于高效、简便、低成本的要求［5］。近年来，环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其快速、高效、灵敏和恒温扩增的特点，成为受到关注的核酸扩增的新技术之一。LAMP 技术利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶，通过对靶基因的6 个区段设计的4 条特异性的引物，在恒温(60～65℃)、短时间(1h)条件下达到对目的基因的高效扩增［6］。由于LAMP 的扩增产物是靶基因的一系列反向重复形成的类似花椰菜结构，电泳呈现的是不同片段大小组成的阶梯式图谱，也可以根据生成的焦磷酸镁沉淀通过肉眼来判断反应是否发生［7］。本研究拟利用环介导等温扩增技术检测肉中的沙门氏菌，并与传统PCR 方法比较，验证其灵敏度和特异性，为这一方法的推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细菌基因组、DNA 提取试剂盒，北京天根生物技术有限公司;Bst 大片段DNA 聚合酶New England Biolabl;dNTP，购自于Promega 公司;甜菜碱 (Betaine)，美国Sigma 公司;DNA marker，北京百泰克生物技术有限公司;琼脂糖，西班牙Biowest 公司;溴化乙锭(EB)，购自于美国sigma 公司。Tc-25/H 型基因扩增仪，美国PCR Kin Elmer Gene Amp;UVP 凝胶成像仪，美国UVP 公司;DYY-10C 型电泳仪，北京市六一仪器厂。实验所用菌株见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的培养以及DNA 模板的提取 取沙门氏菌ATCC14028 作为标准菌株，在营养肉汤培养基中活化3 株沙门氏菌参考菌株及其他8 株非沙门氏菌菌株，在37℃条件下培养过夜。应用细菌基因组提取试剂盒提取处于对数生长期的细菌DNA，将得到的DNA 模板于-20℃保存备用。

1.2.2 LAMP 引物设计与合成 在GenBank 中查找到的决定沙门氏菌侵袭力的肠侵袭蛋白，同时也是高度保守的属特异性基因invA 设计特异性的LAMP 引物［8］。应用Primer Explorer 4.0 引物设计软件，得到的一套特异性引物，引物序列:FIP-CCCAGATCCCCGCATTGTTGAT

表1 实验所用菌株

TTTTCCGCCCCATATTAT C-GCTAT，BIP-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG，F3 -GTTCAACAGCTGCGTCATGA，B3-CGCTATTGCCGGCATCATTA。引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 LAMP 反应体系的建立与优化 25μL 的LAMP 反应体系包括:2 个内引物FIP 和BIP、2 个外引物F3 和B3、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、Mgcl2、甜菜碱、10 × Buffer、DNA 模板，灭菌水补足体系。将混合物在95℃加热5min 后立即冷却，再加入Bst DNA聚合酶1μL，在65℃恒温60min，随即进行酶的灭活，加热到80℃持续2min 终止反应。选择对LAMP 体系中的关键因素进行优化，包括外引物与内引物浓度比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、镁离子浓度(0、1、2、3、4、5、6mmol/L)、dNTP 浓度(0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4mmol/L)、甜菜碱浓度 (0、0.4、0.6、0.8mmol/μL)，根据LAMP 扩增后电泳图条带的有无和亮度选择最适条件，建立LAMP 反应体系。

1.2.4 LAMP 检测沙门氏菌的灵敏度 取1mL 处于对数生长期的沙门氏菌纯培养液，用0.85%生理盐水进行10 倍梯度稀释100～109倍，并采用稀释平板法计算出初始菌液浓度为9.8 ×108CFU/mL。用试剂盒对每个稀释度的沙门菌液提取基因组DNA，并用各个稀释度的DNA 作为模板分别进行LAMP 和PCR 反应。取5μL 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在110V 电压下电泳40min，并利用凝胶成像系统观察结果。

1.2.5 LAMP 检测沙门氏菌的特异性 按照1.2.1 步骤，提取沙门氏菌以及其他8 株非沙门氏菌的DNA，并作为LAMP 反应的模板，进行LAMP 反应，反应产物进行电泳验证。

1.2.6 LAMP 检测人工污染肉中沙门氏菌 鲜猪肉，购自当地农贸市场，人工染菌前经国标法确认不含有沙门氏菌。按照GB/T4789.4-2008，取25g 猪肉样品放入盛有并225mL BPW 的无菌均质袋中，制成1∶10 稀释液。添加108～100CFU/mL 不同稀释度的沙门氏菌纯菌液2.5mL分别与于9 组25mL 稀释液中，均质后沙门氏菌浓度即为107～10－1CFU/mL，分别用试剂盒提取每一组人工污染肉浆中沙门氏菌的DNA，进行LAMP 反应。

2 结果与分析

2.1 LAMP 反应体系的建立

通过优化，确立的最终LAMP 反应体系为:1.6μmol/L 的FIP 和BIP，0.2μmol/L 的F3 和B3，1.6 mmol/L dNTPs，6mmol/L MgCl2，1μL 的Bst DNA 聚合酶(8U)，1mol/L 甜菜碱，2.5μL 10 × Buffer 及2μL模板。对沙门氏菌标准菌株ATCC14028 采用优化的LAMP 体系进行扩增，电泳后如图1，呈现LAMP 特有的阶梯状条带，空白则未出现条带。

图1 沙门氏菌LAMP 检测结果

2.2 LAMP 检测沙门氏菌纯培养物的灵敏度

从图2 可见，沙门氏菌纯培养物在稀释到109倍时没有条带产生，本实验建立的LAMP 方法对沙门氏菌纯培养物的检出限为9.8×100CFU/mL。对比图3 可知，PCR法检测沙门氏菌的灵敏度是9.8×102CFU/mL，因此，本实验建立的LAMP 法的检出限是PCR 的100 倍。

图2 LAMP 检测沙门氏菌纯菌灵敏度电泳图

图3 PCR 检测沙门氏菌纯菌的灵敏度电泳图

2.3 LAMP 检测沙门氏菌的特异性

如图4 所示，4 株沙门氏菌的泳道均有LAMP 特异性的条带产生。其他8 株非沙门氏菌均呈阴性反应，没有出现特异性的阶梯形条带。

2.4 LAMP 检测人工污染肉浆中沙门氏菌的灵敏度

按照1.2.6 所示，人工污染肉浆中沙门氏菌的浓度为9.8×107～9.8×10－1CFU/mL。LAMP 检测人工污染肉中沙门氏菌的检出限为9.8×101CFU/mL (图5)。

3 讨论

图4 LAMP 特异性电泳图

图5 LAMP 检测人工污染肉中沙门氏菌的灵敏度电泳图

目前，分子生物学的发展带动了各种基于核酸扩增的方法在检测致病菌方面的发展。沙门氏菌的分子生物学检测方法主要包括PCR 以及荧光定量PCR，但是复杂昂贵的仪器和对检测人员较高的技术要求使得这一技术不适合在基层推广使用和现场的快速检测［9］。本实验建立的检测肉中沙门氏菌的LAMP 方法快速简便，无需复杂的热循环仪，普通的水浴锅就可以满足温度的要求［10］。由于LAMP 的引物是针对靶基因的6 个区段设计的，因此特异性很强［11］。无论是沙门氏菌的纯培养物还是人工污染的肉样，本实验建立的LAMP 方法灵敏度都可以达到普通PCR 的100 倍，从而具有较高的灵敏度。从反应时间来看，LAMP 从模板制备到结果判断只需要2.5h 左右的时间。即使包括样品12h 的增菌时间，LAMP 只需15h 就可以得出最终结果，而传统方法对阴性样品的确定最短也需要4d［9］。实际样品的LAMP 检测之前的增菌过程是十分必要的，可以减少来自样品中死菌DNA 的影响，相应也可以提高沙门氏菌的检出率［14］。有报道指出LAMP相比较于PCR，不易受食品基质中成分的抑制作用，对DNA 模板纯度要求不高［12］。

尽管LAMP 具有以上众多的优点，其自身的局限性和缺点也是无法避免的。灵敏度高和特异性强的引物对于LAMP 试验起到至关重要的作用，LAMP 需要设计4 条甚至6 条引物，需要考虑许多复杂因素，难度较大［15］。此外，LAMP 灵敏度高的优点也会导致易产生假阳性污染的缺陷，在实际操作过程中，要注意分区操作，防治污染。

总之，快速、灵敏、简便、高效的LAMP 方法为致病菌的检测，特别是基层实验室快速初筛沙门氏菌，提供了一个新的思路［16］。基于LAMP 技术开发的致病菌检测试剂盒也已成功应用于食品检测，这表明LAMP 技术具有良好的发展前景，有望得到更为广泛的应用［17］。

［1］朱胜梅，吴佳佳，徐驰，等.环介导等温扩增技术快速检测沙门菌［J］.现代食品科技，2008，24(7):725-730.

［2］Centers for Disease Control and Prevention.Surveillance for foodborne disease outbreaks-United States，2006.Morbidity and Mortality Weekly Report，2009，58(22):609-615.

［3］GB4789.4-2008 中华人民共和国国家标准，食品卫生微生物检验，沙门氏菌检测［S］.

［4］刘雯静，邱少富，刘雪林，等.沙门氏菌的分子分型方法［J］.现代生物医学进展，2010，10(20):3948-3950.

［5］何翠华，等.应用LAMP 方法检测动物源性食品中沙门菌［J］.中国食品卫生杂志，2010，22(5):411-414.

［6］Notomi T，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA ［J］.Nucleic Acids Research，2000，28(12):63.

［7］王羽，王贞强，张伟.环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中的沙门氏菌［J］.食品科学，2010，31(6):270-273.

［8］Yukiko Hara-Kudo，et al.Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella ［J］.FEMS Microbiology Letters，2005，253:155-161.

［9］黄金海，等.食品中沙门氏菌LAMP 快速检测方法的建立［J］.天津大学学报，2012，45(5):468-472.

［10］Li Wang，et al.Specific and rapid detection of foodborne Salmonella by loop-mediated isothermal amplification method ［J］.Food Research International，2008，41:69-74.

［11］Xihong Zhao，Yanmei Li，Li Wang，et al.Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples ［J］.Mol Biol Rep，2010，37:2183-2188.

［12］Kaneko H，et al.Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances［J］.J Biochem Biophys Methods，2007，70:499-501.

［13］Yasuyoshi Mori，Tsugunori Notomi.Loop-mediated isothermal amplification (LAMP):a rapid，accurate，and cost-effective diagnostic method for infectious diseases［J］.J Infect Chemother，2009，15:62-69.

［14］Pui-Yi Cheung，Kai Man Kam.Salmonella in food surveillance:PCR，immunoassays，and other rapid detection and quantification methods ［J］.Food Research International45:2012，802-808.

［15］蔡哲钧.核酸环介导等温扩增技术［J］.国际检验医学杂志，2006，27(12):1092-1093.

［16］田桢干，阎俊，陆晔，等.LAMP 技术快速检测沙门氏菌方法的建立及其应用［J］.中国国境卫生检疫杂志，2011，34(5):296-299.

［17］张体银，曹以诚，陈洵，等.单核细胞增生李斯特氏菌LAMP 试剂盒的研制及在食品检测中的应用［J］.中国食品学报，2013，13(1):138-144.