葡萄糖调节蛋白-78和磷酸化真核翻译启动因子2α在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

贾跃军, 葛广成, 李中兴, 冯　瑞, 沈　斌, 吴　丹, 王　星

(江苏省镇江市第二人民医院 泌尿外科, 江苏镇江, 212000)



葡萄糖调节蛋白-78和磷酸化真核翻译启动因子2α在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

贾跃军, 葛广成, 李中兴, 冯瑞, 沈斌, 吴丹, 王星

(江苏省镇江市第二人民医院 泌尿外科, 江苏镇江, 212000)

摘要:目的分析葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)及磷酸化真核翻译启动因子2α( P-eIF2α)在正常膀胱黏膜组织和膀胱泌尿上皮癌组织中的表达。方法采用Western blot法检测16对膀胱癌和正常膀胱活检新鲜组织的GRP78和P-eIF2α蛋白的表达水平。采用免疫组织化学方法检测67例膀胱泌尿上皮癌组织中GRP78蛋白的表达，并分析其蛋白表达水平与临床病理特征之间的相关性。结果GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中表达较正常膀胱黏膜组织中上升。免疫组织化学染色结果显示膀胱泌尿上皮癌组织中的GRP78的表达水平与临床分期、浸润深度及淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。结论在膀胱泌尿上皮癌中，GRP78较正常组织中表达上调，并且与膀胱泌尿上皮癌的浸润深度及淋巴结转移相关, P-eIF2α在癌组织与正常组织中表达无显著差异。

关键词:葡萄糖调节蛋白-78; 磷酸化真核翻译启动因子2α; 膀胱尿路上皮癌

膀胱肿瘤是泌尿系统常见肿瘤之一，在中国人群中，是排名第10位的常见恶性肿瘤[1]，其中膀胱尿路上皮癌是最常见的病理类型。2005年，中国死于膀胱癌的患者达17 365人，随着环境因素的恶化，自1995—2005年，膀胱癌的发病率逐年上升[2]。由于膀胱癌易于复发，并且针对T2和T3期膀胱癌的大型随机实验及荟萃分析结果显示，辅助化疗仅可使产生轻度生存获益[3-4]。因此，寻找膀胱尿路上皮癌新的肿瘤标记物和靶向治疗靶点对于膀胱癌的诊断、治疗及预后尤为重要。

葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)是热休克蛋白70家族中的一员，定位于内质网，一方面它协助蛋白质正确折叠，阻止错义蛋白质聚集，另一方面它是未折叠蛋白反应(UPR)通路的核心成员，一旦错义蛋白聚集，GRP78表达增加，并与PEPK、AFT6以及IRE1α分离，从而启动UPR通路[5]。在正常组织如脑、肺、心脏等中，GRP78低水平表达，但在多种肿瘤组织中，它的表达水平明显增加，使肿瘤细胞适应缺氧、葡萄糖缺乏环境，避免凋亡的归宿，并且与预后相关[6-9]。

在真核细胞中，磷酸化真核翻译启动因子2α(P-eIF2α)既可以通过抑制 PI3K-Akt信号通路发挥抗细胞凋亡的作用，又可以通过影响抑癌基因PTEN的功能促进细胞凋亡[10]。 PEPK/eIF2α/CHOP作为内质网应激信号通路之一，eIF2α的磷酸化激活在其中起到了重要的作用。本研究采用Western blot方法检测GRP78和P-eIF2α蛋白在正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌中的表达，以及采用免疫组织化学的方法检测GRP78蛋白在膀胱癌组织中的表达，并探讨其表达与膀胱尿路上皮癌各临床病理参数之间的关系。

1材料与方法

1.1　临床样本与试剂

收集2012—2013年于镇江市第二人民医院及镇江市第一医院泌尿外科就诊膀胱尿路上皮癌患者的新鲜癌组织及正常膀胱黏膜活检组织各16例，收集后立即处理，RIPA裂解提取总蛋白，保存于-80℃冰箱。收集2010—2013年膀胱泌尿上皮癌石蜡样本共67例，全部病理切片经2位资深病理科诊断医师确诊。所有病人术前均未接受放化疗。

1.2　试剂

兔抗人GRP78多克隆抗体和兔抗人P-eIF2α多克隆抗体(Santa Cruz)，辣根过氧化物酶-羊抗兔酶标二抗(Santa Cruz)，其他试剂购自Sigma公司。

1.3　实验方法

1.3.1Western blot法检测GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱尿路上皮癌及癌旁组织中表达:取癌组织及正常膀胱黏膜活检组织(约0.2 g)，加入RIPA裂解液(1 mL/0.1 g组织裂解液内含蛋白酶抑制剂及磷酸化酶抑制剂)，机械低温匀浆，后4 ℃, 12 000 r/min离心15 min, 上清即为总蛋白样品。经Bradford法蛋白定量后，取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。半干式转膜后，经5%脱脂牛奶室温封闭2 h后GRP78(1∶2 000稀释)、P-eIF2α(1∶1 000稀释)4 ℃过夜，TBST液洗膜10 min×3次后，HRP-羊抗兔酶标二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1.5 h, TBST液洗膜5 min×6次，1 mL显影液显影后曝光。

1.3.2免疫组织化学染色:SP法免疫组织化学染色。将石蜡包埋的膀胱泌尿上皮癌组织连续切片为3 μm厚薄片，经二甲苯、梯度浓度乙醇脱蜡水化、经枸橼酸抗原修复液高温高压抗原修复，并使用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，即用型山羊血清封闭非特异性结合位点，滴加适量PBS稀释兔源GRP78一抗(1∶400稀释)止于4 ℃过夜，经PBS充分洗脱后，滴加适量抗兔HRP偶联二抗，室温孵育30 min, 经PBS充分洗涤后，DAB显色，显微镜下观察显色程度，自来水终止显色。苏木素复染，中性树胶封片后，由2位有经验的病理医师各自独立读片。

1.3.3免疫组化判读标准:GRP78阳性部位见于胞浆，偶也可见于胞膜，呈棕黄色。PBS代替抗体作为阴性对照。根据GRP78着色范围及强度评分，着色范围评分标准为：阴性为0，1%～10%为1，11%～50%为2，51%～80%为3，81%～100%为4；染色强度评分标准为：阴性为0，弱为1，中为2，强为3。上两者的乘积为最后得分: 0为(-)，1～4为(+)，5～8为(2+)，9～12为(3+); <5分为低表达组，即阴性组，≥5分为高表达组，即阳性组。膀胱泌尿上皮癌GRP78蛋白表达情况见表1。

2结果

2.1　GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌及癌旁组织中的表达。

Western blot结果显示，GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表达量较正常组织中升高，16对癌与癌旁组织中结果一致，且差异具有统计学意义(P<0.05)。P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表达较正常组织中无明显差异。见图1。

图1 GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌 及癌旁组织中的表达

2.2　GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表达与临床病理参数之间的联系

膀胱泌尿上皮癌中GRP78的表达与年龄、性别、分化程度无关，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关。见表1。

表1　石蜡样本的临床病理信息

3讨论

膀胱泌尿上皮癌作为泌尿系统常见肿瘤之一，具有易复发、生物学行为多样复杂的特点，并且缺乏特异敏感的药物。因此，探索其发病机制，寻找可以预测其预后的肿瘤标记物，以及特异性治疗靶点具有深刻的意义。

GRP-78属于热休克蛋白70家族一员，在正常细胞中主要参与未折叠蛋白反应，降解错义蛋白，维持细胞的正常功能。已有的研究显示，GRP78在肿瘤细胞的增殖方面主要起到以下几方面的作用: ① 肿瘤细胞长期生存于缺氧、葡萄糖匮乏的环境中，往往产生过量的变异新蛋白[11]，引起内质网应激。因此，GRP78在多种肿瘤细胞中过表达以减轻应激，维持细胞的生存和增殖[6-9,12-13]; ② GRP78在维持细胞内Ca2+稳定，维持细胞内环境稳定中起到重要作用。另外，多个研究[14-16]表明, GRP78的过度表达与肿瘤细胞耐药性、肿瘤血管形成相关，对肿瘤细胞使用针对GRP78的药物或者多肽，可诱导细胞凋亡，减少肿瘤血管形成，减轻肿瘤细胞的耐药。

本研究发现，GRP78在膀胱泌尿上皮癌中表达较正常组织中增加，并且在膀胱泌尿上皮癌中GRP78的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移呈正相关，但是与癌组织的分化程度不具有统计学相关性。此研究结果显示，GRP78的表达增加在膀胱泌尿上皮癌的侵袭和转移过程中可能发挥一定的作用。并且，GRP78在膀胱泌尿上皮癌中的表达上调，有可能成为治疗膀胱泌尿上皮癌的潜在靶点。

本研究中，正常膀胱组织中和膀胱泌尿上皮癌中的P-eIF2α表达水平无明显差异，说明在膀胱癌中，eIF2α的磷酸化水平较正常组织中无明显差异，GRP78的上调表达可能并不是通过激活PEPK/eIF2α/CHOP应激信号通路实现的，还需要进一步的研究来探讨GRP78上调与ATF6 和 IRE1/XBP1内质网应激通路在膀胱泌尿上皮癌的发生、发展过程中的作用机制。

综上所述，在膀胱泌尿上皮癌中，GRP78较正常组织中表达上调，并且与膀胱泌尿上皮癌的浸润深度及淋巴结转移相关，说明GRP78在膀胱癌的发生发展中起到重要作用，并可以提示预后。P-eIF2α在癌组织与正常组织中表达没有差异性提示在膀胱癌中PEPK/eIF2α/CHOP内质网应激信号通路没有激活。因此，需要进一步探讨GRP78以及内质网应激通路在膀胱泌尿上皮癌中的作用机制，而且针对GRP78靶向药物能否成为治疗膀胱泌尿上皮癌的新热点仍有待于进一步的探索。

参考文献

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[16]Pi L, Li X, Song Q, et al. Knockdown of glucose-regulated protein 78 abrogates chemoresistance of hypopharyngeal carcinoma cells to cisplatin induced by unfolded protein in response to severe hypoxia[J]. Oncol Lett, 2014, 7(3): 685.

Clinical significance and expression of GRP78 and P-eIF2α in urothelial carcinoma of bladder

JIA Yuejun, GE Guangcheng, LI Zhongxing, FENG Rui,

SHEN Bin, WU Dan, WANG Xing

(DepartmentofUrology,ZhenjiangSecondPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu, 212000)

ABSTRACT:ObjectiveTo analyze the expression and significance of GRP78 and P-eIF2α in bladder urothelial carcinoma and normal mucosa. MethodsWestern blot was used to detect expression of GRP78 and P-eIF2α levels in 16 couples of cancer tissue and normal mucosa. Immunohistochemistry was used to detect expression of GRP78 level in 67 formalin-fixed paraffin-embedded bladder urothelial carcinoma, and correlation between GRO78 level and clinical pathological features was analyzed. ResultsThe results showed that the expression of GRP78 was up-regulated in cancer tissue, and the level of GRP78 expression was correlated with the depth of invasion, positive lymph node metastasis and TNM stage. ConclusionIn bladder urothelial carcinoma, level of GRP78 is up-regulated when compared with normal tissue, and is correlated with the depth of invasion and lymphatic metastasis of bladder urothelial carcinoma, but the expression of P-eIF2α shows no significant difference in carcinoma tissue and normal tissue.

KEYWORDS:GRP78; P-eIF2α; bladder urothelial carcinoma

收稿日期:2015-03-19

中图分类号:R 737.14

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)17-035-03

DOI:10.7619/jcmp.201517011