钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除载体构建

陈小举， 李兴江， 姜绍通

（1.巢湖学院 化学化工与生命科学学院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

琥珀酸是具有潜力的大宗生物基化学品，被广泛应用于食品、化工和医药等产业［1］。作为聚丁二酸丁醇酯（PBS）的合成前体，微生物发酵法生产琥珀酸一直是研究的热点［2－4］。文献［5］对钝齿棒杆菌（Corynebacteriumcrenatum）的研究结果表明，C.crenatum在厌氧发酵时可以分泌大量的琥珀酸。文献［6］在利用C.crenatum厌氧发酵时，流向乳酸的碳代谢流量要远远大于流向琥珀酸的碳代谢流量，C.crenatum所吸收的葡萄糖有70%转化为乳酸，由此可知，乳酸是C.crena－tum厌氧发酵产琥珀酸时的主要副产物。如果要增加琥珀酸的产量，首先需要通过代谢工程减少流向乳酸的碳代谢流量，而敲除乳酸脱氢酶基因（ldhA）可以达到减少乳酸生成的目的，成功构建敲除载体则是敲除乳酸脱氢酶基因的首要环节。

基因敲除是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。该技术已成功应用于Corynebacteriumglutamicum7与Escherichiacoli［8］等琥珀酸生产菌的代谢途径改造，减少了副产物的生成。文献［9］通过构建γ－谷氨酰激酶基因（proB）敲除载体，获得了proB基因缺陷的菌株，摇瓶发酵结果表明，与出发菌株相比，缺陷株生物量降低9.6%，L－精氨酸产量提高13.6%。

插入抗性基因打断目的基因是基因敲除方法的一种，其原理是在目的基因的特定酶切位点处插入一段抗性基因而达到将目的基因完整性予以破坏的目的。本研究旨在构建乳酸脱氢酶基因敲除载体，为后续敲除钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因以增加琥珀酸产量奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

所用质粒如下：pMD18－T simple特征为Apr，ori of ColE1，购自宝生物工程有限公司；pEASYTMT1特征为Apr、kmr、ori of f1，购自全式金生物技术有限公司；pMA特征为pMD18－T simple carryingldhA，pKA特征为pMD18－T simple carryingkm，pMKA 特征为 pMD18－T simple carryingldhA：：Ωkm，均为本实验室研究。

所用菌株如下：CorynebacteriumcrenatumCICC20219为野生、典型菌株，购自CICC；E.coliJM109特 征 为 recA1end A1gyrA96thi－1hsdR17（rk－，mk＋）relA1supE44Δ（lac－proAB）［F’traD36proAB laclqZΔM15］，本实验室保藏。

1.1.2 培养基

LB培养基：葡萄糖（5g／L）、蛋白胨 （10g／L）、酵母膏（5g／L）、NaCl（10g／L），pH 值为7.0，0.1MPa灭菌15min。抗生素为氨苄青霉素（100μg／mL）和卡那霉素（50μg／mL）。

1.1.3 酶与试剂

限制性内切酶、DNA连接酶、低熔点琼脂糖购自TKaRa公司。聚合酶链式反应（polymerase chain raction，PCR）引物合成及PCR试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自爱思进有限公司。氨苄青霉素和卡那霉素为sigma公司产品。DNA marker购自宝生物工程有限公司，型号为250bp DNA Ladder Marker。蛋白胨和酵母膏购自OXOID公司，其他试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器

TC－96PCR仪（杭州博日科技有限公司）、Multiporator电转化仪（Eppendorf公司）、Universal HoodⅡ凝胶成像系统（Bio－Rad公司）。

1.1.5 引物

根据genebank上公布的Corynebacterium glutamicumldhA基因序列和pEASYTM－T3上km序列分别设计2对引物（5′－3′）：

引物P1与P2用于扩增C.crenatum的乳酸脱氢酶基因ldhA，分别含有SalI酶切位点。引物P3与P4用于扩增卡那霉素抗性基因km，分别含有EcoRV酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 DNA 操作

E.coli质粒提取、E.coli感受态细胞制备与CaCl2法转化参照文献［10］。C.crenatum基因组的提取参照文献［11－12］。

1.2.2 PCR 扩增

PCR扩增采用50μL体系。基因ldhA的PCR反 应 条 件 为：94 ℃，3min；94 ℃，1min；55℃，30s；72℃，1min；30个循环后于72 ℃再延伸7min。基因km的PCR反应条件为：94℃，3min；94 ℃，1min；57 ℃，30s；72 ℃，1min；30个循环后于72℃ 再延伸7min。

1.2.3 乳酸脱氢酶基因敲除载体的构建

利用EcoRV内切酶对质粒pMA与PCR扩增的卡那霉素抗性基因片段km进行酶切，分别进行琼脂糖凝胶电泳并回收，将回收后的片段进行连接得敲除载体pMKA，结构如图1所示。

图1 敲出载体pMKA结构简图

以C.crenatum基因组为模板PCR扩增ldhA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果并对片段进行回收。将凝胶回收的ldhA基因片段连入pMD18－T simple质粒，构建重组质粒pMA并转化至E.coliDH5α感受态细胞。筛选阳性转化子，提取pMA质粒，测序验证以确认扩增的片段为ldhA基因。

2 结果与讨论

2.1 ldhA基因片段克隆

以钝齿棒杆菌（C.crenatumCICC20219）基因组DNA为模板，以P1／P2为引物，PCR扩增ldhA基因片段，结果如图2所示。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，1～4泳道出现了比较明亮的条带，且扩增的基因片段大小与预期的片段大小（大约1 000bp）相符，表明PCR扩增的产物为ldhA基因片段。PCR扩增结果较为理想，故而可以进一步对其做胶回收、纯化，留作后续实验所用。

图2 基因ldhA的PCR产物电泳图

2.2 pMA质粒构建

将回收后的ldhA基因片段与pMD18－T simple载体连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌株并提取质粒，以提取的质粒为模板，以P1／P2为引物，PCR扩增ldhA基因片段，以验证ldhA基因片段是否与pMD18－T simple载体连接成功。如果ldhA与pMD18－T simple连接成功，则提取的质粒中必然含有ldhA片段，理论上利用ldhA的PCR体系和程序进行扩增就能得到ldhA的扩增片段。PCR结果电泳图如图3所示。

由图3可知，1、4泳道上未见目的条带，说明提取的质粒中不含ldhA片段，其对应的为假阳性重组子；在2、3、5泳道上有大约1 000bp的条带，大小与目的片段相符，因而可以断定PCR扩增出了ldhA片段，证明ldhA与pMD18－T sim－ple已成功连接，其对应的质粒即为本实验所要构建的pMA载体。

图3 pMA重组质粒的PCR验证

2.3 卡那霉素抗性基因km的克隆

以质粒pEASYTM－T1为模板，以P3／P4为引物，PCR扩增km基因片段。琼脂糖凝胶电泳图如图4所示。由图4可以看出，在PCR扩增的2管平行样所对应的2、3泳道上可见明亮条带，且条带大小与目的片段相符，表明扩增产物为目的片段，且PCR扩增结果较为理想，故而可以进一步对其做胶回收、纯化，然后连入pMD18－T simple质粒，得到质粒pKA。

图4 基因km的PCR产物电泳图

2.4 乳酸脱氢酶基因敲除载体的构建

将质粒pMA进行EcoRV酶切并回收大片段，同时将质粒pKA进行EcoRV酶切并回收小片段，然后将分别回收的片段进行连接，得到质粒pMKA。将质粒pMKA转化为大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌株并提取质粒，以提取的质粒为模板，以P1／P2为引物进行PCR扩增与酶切验证。PCR结果如图5所示。由图5可知，在实验的4个平行样中，只有1、4泳道在2 250bp附近的位置出现目的条带，其大小正好符合ldhA与km片段之和，表明pMA质粒与km连接成功。

敲除质粒pMKA的实际大小为4 714bp左右，经过SalI酶切后应得到2个片段，一个是质粒pMD18－T simple除去小片段后剩下的部分，大小约为2 600bp，另一个是km片段和ldhA基因片段组成的大小约为2 200bp的片段。

图5 pMKA重组质粒PCR验证

为了验证km片段是否能成功连接到乳酸脱氢酶基因中的EcoRV特异性酶切位点，本文对pMKA敲除质粒进行了SalI与EcoRV酶切验证。酶切结果如图6所示。

由图6a可知，在1泳道与2泳道分别有2条条带，其大小约为2 600bp和2 200bp，表明km基因片段成功插入到ldhA片段中。由图6b可知，泳道2中有2条条带，分别为经EcoRV酶切的km基因片段（1 000bp左右）和去掉km基因片段的pMKA剩余片段（3 700bp左右），表明km基因片段成功连入到ldhA片段中的EcoRV酶切位点，ldhA敲除质粒pMKA构建成功。

图6 敲除质粒pMKA的酶切鉴定

3 结束语

本文利用钝齿棒杆菌厌氧发酵产琥珀酸时，乳酸是其主要副产物。乳酸脱氢酶是钝齿棒杆菌发酵产乳酸的关键酶，通过构建乳酸脱氢酶基因敲除载体可以用于敲除乳酸脱氢酶基因以达到减少乳酸生成、增加琥珀酸产量的目的。为此本文主要介绍了乳酸脱氢酶基因敲除载体的构建方法及主要过程。首先将克隆到的ldhA基因与质粒pMD18－T simple连接得到质粒pMA，再将km基因插入到ldhA基因中的EcoRV酶切位点，得到载体pMKA。质粒PCR与酶切结果显示乳酸脱氢酶基因敲除载体构建成功，可以用于后续乳酸脱氢酶基因的敲除实验。

［1］ Sauer M，Porro D，Mattanovich D，et al.Microbial production of organic acids：expanding the markets［J］.Trends in Biotechnology，2008，26（2）：100－108.

［2］ 薛培俭，姜绍通，李兴江，等.发酵秸秆糖产丁二酸放线杆菌的CO2固定关键酶特性分析［J］.合肥工业大学学报：自然科学版，2010，33（7）：1066－1069.

［3］ Akhtar J，Idris A，Aziz R A.Recent advances in production of succinic acid from lignocellulosic biomass ［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（3）：987－1000.

［4］ 李长存，刘洪武，邓 琼.聚丁二酸丁二醇酯产业现状及技术进展［J］.合成纤维工业，2014，37（2）：60－63.

［5］ Chen Xiaoju，Jiang Shaotong，Li Xingjiang，et al.Production of succinic acid and lactic acid byCorynebacteriumcrenatumunder anaerobic conditions［J］.Annals of Microbiology，2013，63（1）：39－44.

［6］ Chen Xiaoju，Jiang Shaotong，Zheng Zhi，et al.Effects of culture redox potential on succinic acid production byCorynebacteriumcrenatumunder anaerobic conditions［J］.Process Biochemistry，2012，47：1250－1255.

［7］ Wang Chen，Zhang Hengli，Cai Heng，et al.Succinic acid production from corn cob hydrolysates by genetically engineeredCorynebacteriumglutamicum［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，172：340－350.

［8］ Liu Rongming，Liang Liya，Li Feng，et al.Efficient succinic acid production from lignocellulosic biomass by simultaneous utilization of glucose and xylose in engineeredEscherichiacoli［J］.Bioresource Technology，2013，149：84－91.

［9］ 李小曼，赵 智，张英姿，等.γ－谷氨酰激酶基因敲除对产L－精氨酸钝齿棒杆菌8－193生理代谢的影响［J］.微生物学报，2011，51（11）：1476－1484.

［10］ Sambrook J，Russell D W.分子克隆实验指南：上册［M］.第3版.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：96.

［11］ 余秉琦，沈 微，诸葛健.适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法［J］.中国生物工程杂志，2005，25（2）：78－81.

［12］ Peters－Wendisch P，Stolz M，Etterich H，et al.Metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicumfor L－serine production［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（11）：7139－7144.