胸腔积液酶联免疫斑点检测对结核性胸膜炎的诊断价值

崔　丹，赵　杰，冯秀莉，李志惠(河北省胸科医院结核一科，河北 石家庄 050041)



·论著·

胸腔积液酶联免疫斑点检测对结核性胸膜炎的诊断价值

崔丹，赵杰，冯秀莉，李志惠*(河北省胸科医院结核一科，河北 石家庄 050041)

[摘要]目的探讨胸腔积液酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)诊断结核性胸膜炎的临床价值。方法将收治的胸腔积液患者163例分为结核性胸膜炎组(结核组)103例和非结核性胸膜炎组(对照组)60例。对所有胸腔积液患者进行ELISPOT、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)检测。结果结核性胸腔积液中ELISPOT及ADA水平显著高于非结核性胸腔积液(P<0.01)。ELISPOT诊断结核性胸膜炎的敏感度(92.2%)，高于ADA的敏感度(81.6%)。ELISPOT诊断结核性胸膜炎的特异度(93.3%)，与ADA的特异度(91.7%)差异无统计学意义(P>0.05)。结论ELISPOT诊断结核性胸膜炎敏感度高，同时具有很好的特异度，可作为诊断结核性胸膜炎的重要参考指标。

[关键词]结核，胸膜；胸腔积液；酶联免疫斑点测定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.005

结核性胸膜炎是胸膜由结核分枝杆菌侵犯及机体对结核蛋白成分过敏状态的胸膜炎症，是临床常见的肺外结核病。传统诊断结核性胸膜炎的方法如结核菌培养及胸水抗酸染色阳性率极低，胸腔积液腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)检测是目前诊断结核性胸膜炎常用的且较为准确的指标之一，但其敏感度较低；故目前结核性胸膜炎的诊断依然还需要通过病史、影像学和疗效观察等一系列临床表现，尚缺乏敏感度及特异度较高的指标。酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是通过检测外周血及体液中结核特异性释放γ干扰素水平(interferon-γ,IFN-γ)来检测结核感染的方法，因其敏感度及特异度高[1]，在发达国家广泛应用。由于结核感染具有隔室化效应[2]，即抗原特异性T细胞向病变部位集中，故结核性胸膜炎胸腔积液的ELISPOT有可能较外周血具有更高的诊断价值[3-4]。本研究通过ELISPOT方法检测103例结核性及60例非结核性胸腔积液的IFN-γ水平，探讨胸腔积液ELISPOT对结核性胸膜炎的诊断意义。现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2011年12月—2013年12月我科收治的胸腔积液患者(剔除诊断不明确及无病理、细菌学相关证据临床诊断的结核性胸膜炎)163例。结核性胸膜炎患者(结核组)103例，男性53例，女性50例，年龄19～69岁，平均(45±16)岁；其中胸腔积液抗酸染色阳性43例，罗氏培养结果阳性36例，胸膜组织活检病理明确诊断24例。非结核性胸膜炎患者(对照组)60例，男性34例，女性26例，年龄21～69岁，平均(51±17)岁；其中肿瘤性胸腔积液47例，原发胸膜恶性病变7例，肺炎旁积液6例。肿瘤病理均经过病理细胞学证实，其他疾病经常规检验、影像学及疗效等证实。所有入选病例均无均艾滋病，病毒抗体阴性，无合并糖尿病及风湿免疫系统疾病，无严重心、肝、肾功能不全。

1.2方法

1.2.1ELISPOT采用英国Oxford Immunotec公司生产的T-Spot-TB试剂盒，于治疗前取新鲜胸腔积液100 mL立即进行检测(样本采集后2 h内送实验室，4 h内完成检测)。胸腔积液分离得到胸水单个核细胞并制备成浓度为2.0×106/mL的细胞悬液。细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素(phytohae magglutinin,PHA)作为阳性对照，结核菌特异性抗原早期分泌抗原靶6(early secretory antigen 6，ESAT-6)和培养滤液蛋白10(culture fitrate protein,CFP-10)作为刺激抗原。每孔加入含2.5×105个细胞的细胞悬液，将微孔板放在含5%二氧化碳的培养箱中培养18～20 h，第2天洗板后加入生物素标记的二抗，2～8 ℃反应1 h，洗板后加入显色底物液，室温静置7 min，去离子水终止反应。通过细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)酶联免疫斑点系统记录斑点数。结果判定标准：当空白对照孔内斑点数<6时任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6，结果即为阳性；若空白对照孔斑点数≥6，任一实验孔斑点数≥2倍空白孔斑点数结果即为阳性。否则为阴性。

1.2.2ADA检测取新鲜胸腔积液10 mL，以1 000 r/min离心5 min，取上清液用酶法测定ADA活性，参照试剂盒说明进行诊断，ADA≥45 U/L定义为阳性。

1.3统计学方法应用SPSS 18.0统计软件分析数据，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ELISPOT和ADA检测阳性率比较结核组胸腔积液中ELISPOT和ADA检测水平显著高于对照组(P<0.01)，见表1。

表1　2组胸腔积液ELISPOT和ADA检测水平比较

2.2ELISPOT和ADA检测的敏感度和特异度ELISPOT的敏感度92.2%(95/103)、特异度93.3%(56/60)，高于ADA检测的敏感度81.6%(84/103)、特异度91.7%(55/60)。

2.3ROC曲线分析胸腔积液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲线下面积分别为0.913(95%CI为0.891～0.970)和0.901(95%CI为0.832～0.960)。ADA的最优截断点为42.581 U/L；胸腔积液ELISPOT的SFC数≥176/106胸水单个核细胞为诊断界值，可获得相对较高的诊断敏感度及特异度。

3讨论

胸腔积液的鉴别一直是临床诊断的一个难点，其中结核性胸膜炎占胸膜疾病的49.6%，且发病呈逐年上升趋势[5]。结核性胸膜炎的诊断金标准是胸水中找到或培养出结核分枝杆菌，但因阳性率低[6]；胸膜活检虽然特异度较高，但其创伤较大限制了其广泛应用。由于现有方法诊断结核性胸膜炎的局限性，迫切需要一种快速、敏感的诊断技术来提高结核性胸膜炎的诊断效率。

ELISPOT是检测细胞免疫功能的方法，已广泛应用到结核分枝杆菌感染的快速诊断中[7]。当机体感染结核后产生致敏淋巴细胞，经外源性特异抗原刺激后可产生效应T细胞。T-Spot-TB是利用结核特异抗原ESAT-6、CFP-10，通过ELISPOT检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前是否感染结核杆菌的新方法。

目前外周血单个核细胞结核菌特异性IFN-γ的ELISPOT已广泛应用于结核感染的诊断，但由于外周血ELISPOT不能区分潜伏和活动性结核病，导致诊断特异度受限[8]。结核感染局部有隔室化效应，直接来源于胸膜腔的胸液局部细胞数量显著高于外周血。有文献报道结核性胸膜炎患者胸腔中效应T细胞数量较外周血高10～15倍[9]。Wilkinson等[10]研究证实胸腔积液的ELISPOT对结核性胸膜炎的诊断效能远大于外周血。ADA是人体嘌呤核苷代谢中的一种酶,广泛存在于全身各组织器官中，其中淋巴细胞特别是T 细胞内ADA的含量最高。有资料显示结核性胸膜炎时胸腔积液中的ADA 含量明显增高,主要与T 淋巴细胞受到抗原刺激后激活、增殖、分化明显增多有关[11]。目前认为ADA是传统诊断结核性胸膜炎的重要指标，在很多国家已成为诊断结核性胸膜炎的常规检查项目。本研究结果显示，结核组胸腔积液中ELISPOT和ADA检测水平显著高于对照组，差异有统计学意义；胸腔积液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲线下面积分别为0.913(95%CI为0.891～0.970)和0.901(95%CI为0.832～0.960)，表明胸腔积液的ELISPOT和ADA检测均可作为诊断结核性胸膜炎的参考指标，胸腔积液ELISPOT的SFC数≥176/106胸腔积液单个核细胞为诊断界值，可获得相对较高的诊断敏感度及特异度。

本研究结果显示，ADA检测与ELISPOT诊断结核性胸膜炎的特异度相近(91.7%vs93.3%)，但ELISPOT在结核性胸膜炎早期诊断中具有较胸腔积液ADA检测更高的敏感度(92.2%vs81.6%)。ELISPOT可作为诊断结核性胸膜炎的重要辅助诊断指标。如果ELISPOT与ADA检测联合则可进一步提高结核性胸膜炎的诊断效率。

由于本研究受到样本量的限制，故其结论尚有待进一步证实。

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(本文编辑：刘斯静)

Enzyme-linked immunospot assay in diagnosis of tuberculous pleurisy

CUI Dan,ZHAO Jie,FENG Xiu-li,LI Zhi-hui*

(Department of Tuberculosis,Hebei Chest Hospital,Shijiazhuang 050041,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the enzyme-linked immunospot assay(ELISPOT) in the diagnosis of tuberculous pleurisy.MethodsA total of 163 pleural effusion patients admitted to hospital were enrolled.The patients were divided into tuberculous pleurisy group and non tuberculous pleurisy group.The pleural effusion in all patients was detected by ELISPOT and adenosine deaminase(ADA) activity was tested.ResultsELISPOT and ADA activity were significantly higher in tuberculous pleural effusion than non tuberculous pleural effusion(P<0.01).The sensitivity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 92.2%,was higher than ADA sensitivity,81.6%.The specificity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 93.3%,showed no significant difference as compared with ADA specificity,91.7%.ConclusionELISPOT can be a useful tool in diagnosing tuberculous pleurisy and is specific.

[Key words]tuberculosis,pleural；pleural effusion；enzyme-linked immunospot assay

[中图分类号]R521.7

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)12-1384-03

*通讯作者

[作者简介]崔丹(1982-)，女，河北任丘人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事结核性疾病诊治研究。

[收稿日期]2015-04-15；[修回日期]2015-06-24