基于高效液相色谱的一种测定鸡蛋中三聚氰胺残留的方法

蔡良英，赵 阳，丁春燕，陶 芸

（湖州市德清县食品药品检验所，浙江湖州 313200）

基于高效液相色谱的一种测定鸡蛋中三聚氰胺残留的方法

蔡良英，赵 阳，丁春燕，陶 芸

（湖州市德清县食品药品检验所，浙江湖州 313200）

针对鸡蛋中的三聚氰胺，建立一套基于高效液相色谱的快速测定方法。以50%甲醇－1%三氯乙酸为提取溶液，经超声、离心、正己烷除脂后，阳离子固相萃取柱净化，采用庚烷磺酸钠离子对试剂∶乙腈（85∶15，V∶V）为流动相，C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），外标法定量。该方法在0.5～80μg·mL－1线性良好，相关系数为0.999 8，加标回收率94.58%～97.62%，定量限为0.3mg·kg－1。

三聚氰胺；高效液相色谱；鸡蛋

三聚氰胺是一种重要的化工原料，属于非蛋白质含氮化合物，含氮量高达66.67%，常被违规加入食品中以提升蛋白质含量指标。近年来发生的一系列含三聚氰胺有毒食品事件严重损害我国居民的身体健康，引发了社会各界的广泛关注。目前，食品中三聚氰胺的测定方法主要有液相色谱法［1－2］、气相色谱串联质谱法［3］、高效液相串联质谱法［4－5］、毛细管电泳法［6－7］、离子色谱法［8］、酶联免疫吸附法［9］、表面等离子体共振（SPR）技术［10－11］、近红外光谱法［12］以及表面增强拉曼光谱法［13－14］，其中，高效液相色谱法操作相对简单、运行成本低、是目前最为常用的检测方法。由于样本基质的差异性，针对饲料、乳制品中三聚氰胺建立起来的测定方法并不适用于鸡蛋的测定。本文拟在现有国家检测标准基础上，简化样品前处理过程、优化色谱条件，建立针对鸡蛋中三聚氰胺的高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

美国Agilent 1260型高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器）；C18色谱柱（Agilent，5μm，4.6 mm×250 mm）；PCX固相萃取小柱（美国Agilent公司）。甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），三氯乙酸（分析纯），庚烷磺酸钠（色谱纯），三聚氰胺标准品（≥99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 标准溶液配制

准确称取三聚氰胺标准品100 mg于100 m L容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg·mL－1的标准储备液，于4℃避光保存。临用前用50%甲醇水稀释标准储备液得到标准系列进行测定。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

取鸡蛋打碎后用匀质器匀质1min，称取5 g（精确至0.01 g）于25 mL具塞比色管，加入15 mL 1%三氯乙酸、5mL 50%甲醇，超声提取20min后加1%三氯乙酸定容，6 000 r·min－1离心10min。取上清液加入三氯乙酸饱和的正己烷除脂，8 000 r·min－1 4℃离心10min，取上清液5mL待净化。

1.3.2 净化

依次用3 mL甲醇、3 mL 1%三氯乙酸活化固相萃取小柱。将待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3 mL 1%三氯乙酸、3 mL甲醇洗涤。抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液分2次洗脱。洗脱液于50℃用氮气吹至近干，残留物用流动相定容，旋涡混合1 min，移取上清液过0.45μm微孔滤膜后，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为庚烷磺酸钠离子对试剂缓冲溶液／乙腈混合液（85∶15，V／V）；流速1.0 mL·min－1；柱温40℃；检测波长240 nm；进样量20μL。以保留时间定性，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件选择

三聚氰胺具有弱碱性，可溶于甲醇和乙腈，而三氯乙酸能使其转化成盐。考虑到乙腈的毒性和沉淀蛋白条件，本文选用50%甲醇和1%三氯乙酸为提取液。1%三氯乙酸能够给三聚氰胺提供酸性环境，使其很好地溶解在上清液中，减少目标检测物的损失。考虑到鸡蛋与牛奶样品的差异，在提取液中特别加入甲醇沉淀蛋白，同时增加正己烷去脂步骤，以达到较好的净化效果。

另有文献［15－16］报道，提取液不经过小柱净化而直接进样测定，虽然节约了检测成本，但长时间、大批量的检测样品会对仪器，尤其是色谱柱造成不良影响。小柱洗脱过程中存在离子交换，为使洗脱液与萃取柱填充物充分接触，洗脱速度不宜过快。试验表明，洗脱流速小于1.5 mL·min－1时，回收率较理想。

2.2 方法评价指标

2.2.1 测定方法的线性范围和检出限

配制一系列浓度的三聚氰胺标准溶液，按色谱峰面积对三聚氰胺进样浓度进行线性回归，其线性范围为0.5～80μg·m L－1，线性方程为A＝85.655C＋3.149，相关系数为0.999 8。三聚氰胺标准图谱见图1。按信噪比（S／N）为10计算，本方法定量限为0.3mg·kg－1。目前，我国国家标准中对食品中三聚氰胺的安全限值设定为2.5 mg· kg－1，可知本方法可以满足检测的要求。

图1 三聚氰胺标准图谱

2.2.2 加标回收率和精密度

准确称取鸡蛋样品5.00 g，分别进行0.40，1.00，2.00，4.00 mg·kg－1 4个水平的加标回收和精密度试验，每个添加浓度做6个平行。回收率精密度结果见表1。结果表明，在0.40～4.00 mg· kg－1的添加水平上，样品的回收率为94.58%～97.62%，相对标准偏差为0.77%～3.09%，符合测定要求。添加1.00 mg·kg－1三聚氰胺标准品的鸡蛋样品以及空白鸡蛋样品的液相色谱图见图2。

表1 精密度试验及加标回收率试验结果（n＝6）

图2 三聚氰胺加标样品（a）与空白样品（b）液相色谱图

3 小结

本文建立起一套基于高效液相色谱的快速检测鸡蛋中三聚氰胺的方法，该方法前处理过程简单，测试结果稳定且精确度较高，可满足实际检测要求。

［1］ 黄儒添，廖少平，叶小玲.牛乳中三聚氰胺残留量的高效液相色谱检测分析［J］.中国医药指南，2014（5）：58－59.

［2］ Venkatasami G，Sowa J R.A rapid，acetonitrile⁃free，HPLC method for determination of melamine in infant formula［J］. Analytica Chimica Acta，2010，665（2）：227－230.

［3］ Yokley R A，Mayer L C，Rezaaiyan R.Analytical method for thr determination of cyromazine and melamine residues in soilusing LC⁃UV and GC⁃MSD［J］.Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2000，48（8）：3352－3358.

［4］ 胡梅，王骏，张卉，等.超高效液相色谱⁃质谱／质谱测定禽蛋制品中三聚氰胺［J］.山东农业科学，2010（1）：59－62.

［5］ 李爱军，张代辉，马书民，等.液相色谱⁃串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留［J］.分析化学，2008（5）：699－701.

［6］ Cook H A，Klampfl CW，BuchbergerW.Analysis ofmelamine resins by capillary zone electrophoresis with electrospray ionization⁃mass spectrometric detection［J］.Electrophoresis，2005，26（7）：1576－1583.

［7］ 王士伟，邓光辉，屈忠凯，等.毛细管电泳电化学发光法分离测定奶粉中的二聚氰胺和三聚氰胺［J］.分析试验室，2014（10）：20.

［8］ 林立，王海波，梁立娜.离子色谱⁃紫外检测测定液态奶中的三聚氰胺［J］.食品科学，2009，30（14）：240－242.

［9］ 陈锡龙，黄瑾，钱莘莘.使用酶联免疫吸附法测定饲料中三聚氰胺的研究［J］.饲料工业，2008，29（18）：53－55.［10］ 张婉洁，苏洋，徐可欣，等.一种利用同一表面等离子体共振传感器检测多种残留物的方法［J］.化学学报，2010，68（24）：2574－2580.

［11］ 邓绍立，崔大付，廉双秋.利用表面等离子体共振生物传感器快速检测牛乳中的三聚氰胺［J］.乳业科学与技术，2015，38（1）：19－21.

［12］ 黎静.大豆源蛋白饲料原料中三聚氰胺／三聚氰酸的近红外显微成像分析方法研究［D］.北京：中国农业大学，2014.［13］ 杨欣，王军，苗虹，等.牛乳中三聚氰胺的表面增强拉曼光谱检测法与国标检测法的比较［J］.食品安全质量检测学报，2014（10）：3219－3222.

［14］ 王巧华，刘亚丽，马美湖，等.表面增强拉曼光谱检测鸡蛋蛋清内三聚氰胺的定量方法研究［J］.光谱学与光谱分析，2015，35（4）：919－923.

［15］ 郭铁筝，潘国卿，赵治国，等.牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速测定方法［J］.内蒙古师范大学学报：自然科学版，2012，41（4）：406－409.

［16］ 尹利辉，王军，王瑾，等.高效液相色谱法快速测定奶粉中三聚氰胺的含量［J］.药物分析杂志，2011，31（10）：1938－1940.

（责任编辑：高 峻）

O 657.7；TS 253.7

A

0528⁃9017（2015）11⁃1772⁃02

文献著录格式：蔡良英，赵阳，丁春燕，等.基于高效液相色谱的一种测定鸡蛋中三聚氰胺残留的方法［J］.浙江农业科学，2015，56（11）：1772－1773，1776.

DOI 10.16178／j.issn.0528⁃9017.20151121

2015⁃09⁃06

蔡良英（1988－），女，浙江湖州人，硕士，主要从事食品药品检验与分析工作。E⁃mail：liangying_cai＠126.com。