程序性细胞死亡因子4在视网膜母细胞瘤组织中的表达及与临床病理的关系研究

武犁 周芸芸 陈樱

·临床研究·

程序性细胞死亡因子4在视网膜母细胞瘤组织中的表达及与临床病理的关系研究

武犁 周芸芸 陈樱

目的探讨视网膜母细胞瘤(RB)组织中程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达及其与临床分期和组织分化的关系。方法应用免疫组织化学S-P法检测PDCD4在35例RB组织中的表达；用MPIAS-500彩色病理图像分析系统测量其平均积分光密度值。结果在35例RB组织切片中，均可见PDCD4的阳性表达，其表达水平明显低于正常视网膜组织(P<0.05)；眼外扩展期组PDCD4的表达水平明显低于眼内生长期组和眼压增高期组(P<0.05)；PDCD4 在RB的阳性表达水平与肿瘤组织的分化程度及视神经浸润显著相关(P<0.05)。结论PDCD4蛋白表达水平与RB的临床分期、视神经浸润以及组织分化有关，PDCD4可作为判断RB浸润及预后的指标。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：403-405)

视网膜母细胞瘤；程序性细胞死亡因子4；免疫组织化学；组织分化

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是一种起源于胚胎型视网膜细胞的恶性肿瘤，是婴幼儿最常见、最严重的眼内恶性肿瘤，严重危害患儿视力甚至生命[1]。作为第1个分离出的人类抑癌基因，RB基因突变而导致的失活是RB发生的重要机制。程序性细胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4) 作为近年来新发现的抑癌基因，能够通过抑制蛋白转录和翻译过程抑制肿瘤细胞的生长。有研究[2-5]提示：PDCD4 的表达水平可能与包括RB在内的某些肿瘤的发生及恶性程度有关。我们采用免疫组织化学方法探讨新抑癌基因PDCD4蛋白的表达与RB的临床分期及组织分化的相关性，为RB的病情进展及预后判断提供理论依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 经临床病理证实为RB且资料完整的RB患者35例，其中男性22例、女性13例；年龄9个月～12岁，平均 (3.8±1.6)岁。均为单眼发病，右眼15例、左眼20例。按照传统临床分期[6]，本组病例中，眼内生长期11例，眼压增高期14例，眼外扩展期10例。眼压增高是通过非接触式眼压计或修氏眼压计进行测量。依据Stannard等[7]的分类方法，根据视神经受侵犯程度来分，N0：视神经未受侵袭；N1：肿瘤侵犯视乳头，但局限于筛板内；N2：肿瘤侵犯筛板后视神经，但视神经切除断端未见肿瘤；N3：视神经断端可见肿瘤。本组病例中，N0期14例、N1期8例、N2期9例、N3期4例。按照苏木素-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色病理切片的表现来分，R0：肿瘤细胞不呈菊花团排列(每高倍镜视野内菊花团排列数<3个)；R1：仅有少数肿瘤细胞呈菊花团排列(每高倍镜视野内菊花团排列数3～5个)；R2：多数肿瘤细胞呈菊花团排列(每高倍镜视野菊花团排列数>5个)。本组病例中，R0 15例、R1 6例、R2 14例。所有RB患者的肿瘤组织均取自球内。另取6例角膜移植供体眼视网膜组织作为对照，供体眼均为自愿捐献者，无视网膜疾病史。

1.2 主要试剂 鼠抗人PDCD4多克隆抗体；免疫组织化学S-P试剂盒及二氨基联苯胺(diamino benzidine, DAB)显色剂及中性树胶等均采购自北京中山生物技术公司。

1.3 免疫组织化学染色 采用S-P法进行染色，主要步骤如下：石蜡标本行4.0 μm厚连续切片，脱蜡，梯度乙醇水化，30 g/L过氧化氢溶液室温孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶；微波修复抗原，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗；滴加一抗，4 ℃湿盒过夜；漂洗后，滴加二抗工作液，37 ℃湿盒内孵育30 min；洗涤后，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，置湿盒内，37 ℃孵育30 min；DAB显色，光学显微镜下观察染色结果；满意后水洗终止，苏木素衬染，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。PBS代替一抗做阴性对照。每个病例做5张切片，重复3次。利用MPIAS-500彩色病理图像分析系统光学显微镜下观察并测量PDCD4蛋白在正常视网膜和RB组织中的积分光密度，每张切片选取10 个视野。

2 结果

2.1 PDCD4蛋白表达 在35例RB组织切片中均可见PDCD4蛋白阳性表达 (图1)，平均积分光密度值为0.197±0.014；6例正常视网膜组织中，PDCD4蛋白亦呈阳性表达，平均积分光密度值为0.225±0.013，明显高于RB组织，两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。2.2 PDCD4蛋白表达水平与临床分期及视神经浸润的关系 PDCD4蛋白表达在眼内生长期组、眼压增高期组和眼外扩展期组的积分光密度值分别为0.210±0.012、0.207±0.010和0.169±0.014。眼外扩展期组明显低于眼内生长期组和眼压增高期组，差异有统计学意义(P<0.05)；而眼内生长期和眼压增高期组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图1. PDCD4在RB组织中的阳性表达 SP×400

PDCD4 蛋白在N0期、N1期、N2期和N3期各组的积分光密度值分别为：0.214±0.012、0.207±0.013、0.187±0.011和0.178±0.009，PDCD4蛋白积分光密度值与肿瘤组织视神经浸润相关(P<0.05)，视神经浸润组PDCD4蛋白积分光密度值明显低于视神经无浸润组，差异有统计学意义 (P<0.05)。

2.3 PDCD4蛋白表达水平与病理组织分化的关系 35例RB中，不同分化型组织中PDCD4蛋白积分光密度值分别如下，R0： 0.182±0.011，R1:0.198±0.012，R2：0.224±0.011，PDCD4蛋白积分光密度值与肿瘤组织分化程度相关(P<0.05)，未分化组PDCD4蛋白积分光密度值明显低于分化组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

PDCD4是新近发现的抑癌基因之一，它定位于染色体10q24。PDCD4蛋白由 469个氨基酸组成，包含N末端结构域、 C末端结构域和2个保守的α螺旋MA-3结构域[2]。虽然PDCD4基因在肿瘤发生中的详细作用机制尚不清楚[2-3]，但是已有的研究显示：PDCD4基因可能通过多种途径参与细胞凋亡调控，发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移作用。有研究[8-9]表明：PDCD4可能在转录、翻译和信号转导途径中通过抑制转录阻遏基因EIF4A，从而调节蛋白质的合成，最终抑制了细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。另有研究[10-11]证明，PDCD4 mRNA水平在胶质瘤中表达缺失率为47%，而蛋白表达的缺失率达到了77%，从而推测PDCD4在人神经胶质瘤中的表达缺失应该比较常见。还有研究[12]发现，PDCD4转染可以抑制U251细胞的细胞增殖和克隆，并且影响了U251细胞系的细胞周期，使细胞周期停留在S期，从而抑制肿瘤的恶性转化。Shen等[5]的研究显示：miR-21下调引起突变RB基因的表达，而PDCD4可能在这一过程中发挥着重要的作用，提示PDCD4可能与RB的发生、发展有关。

有报道[13]称,低表达的PDCD4 与胃癌的临床分期进展、组织浸润深度及远处转移相关。Ren 等[14]研究发现，miR-183的过表达可抑制PDCD4 的功能，从而导致食管鳞状细胞癌的增殖和侵袭。我们的研究结果与此类似，发现：PDCD4蛋白在RB患者眼外扩展期组表达明显低于眼内生长期组和眼压增高期组，差异有统计学意义；而眼内生长期和眼压增高期组间差异无统计学意义。同时，RB肿瘤细胞浸润视神经组PDCD4蛋白表达量明显低于未浸润组，表明PDCD4蛋白表达不仅与RB的临床分期有关，而且与RB的视神经浸润能力有关，即RB组织中PDCD4蛋白表达量越低，其浸润潜能越强，也就越易发生浸润与转移。

我们的观察结果还显示：RB组织中，PDCD4蛋白表达与组织分化程度有关，未分化型PDCD4蛋白的表达量明显低于分化型。Tu等[15]也发现胃癌组织的PDCD4 蛋白表达与肿瘤的分化程度呈负相关，即高分化的胃癌表现为高表达PDCD4 蛋白，低分化的胃癌表现为低表达PDCD4 蛋白。以上结果说明，细胞分化差和增殖能力强的肿瘤转移潜能大，其预后会更差。因此，观察RB组织中PDCD4蛋白的表达对了解RB的组织学特性也有重要的意义。

综上所述，PDCD4蛋白表达与RB的临床分期及组织分化具有重要的相关性，PDCD4可作为判断RB的恶性程度、视神经浸润以及转移的重要指标，深入探讨 PDCD4蛋白与RB的相关性对RB的治疗与预后判断具有重要的指导意义。

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(本文编辑 诸静英)

Expression of programmed cell death 4 and its relationship with clinical stage and histodifferentiation in retinoblastoma

WULi,ZHOUYun-yun,CHENYing.

DepartmentofOphthalmology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

WU Li, Email: wlpzy2007@163.com

Objective To investigate the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in retinoblastoma (RB) and its relationship with clinical stage and histodifferentiation. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of PDCD4 in RB samples of 35 cases. The quantitative analysis of the PDCD4 expression was assessed by using MPIAS-500 color pathologic analysis system. Results PDCD4 was expressed positively in the all 35 Rb specimens. The level of PDCD4 expression was significantly lower in RB than that in normal retina tissues (P<0.05). The expression of PDCD4 was related to the histodifferentiation and optic nerve infiltration (P<0.05). Conclusions The expressions of PDCD4 was associated with clinical stage and histodifferentiation in RB. PDCD4 may become a new marker for the invasion and prognosis of RB. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:403-405)

Retinoblastoma；Programed cell death 4；Immunohistochemistry；Histodifferentiation

武汉大学人民医院眼科 武汉 430060

武犁 (Email: wlpzy2007@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.008

2015-06-05)