新型mTORC1/mTORC2双重抑制剂OSI-027对人结肠癌细胞株HT-29的体外抑制作用

陈国平　曹大春　刘海林

(上海交通大学医学院附属第九人民医院消化科，上海　200011)



·论著·

新型mTORC1/mTORC2双重抑制剂OSI-027对人结肠癌细胞株HT-29的体外抑制作用

陈国平曹大春刘海林

(上海交通大学医学院附属第九人民医院消化科，上海200011)

摘要目的：探讨新型mTORC1/mTORC2双重抑制剂OSI-027对人结肠癌细胞株HT-29的体外抑制作用。方法：体外培养的人结肠癌HT-29细胞株，给予不同浓度(0.1、1、10、25、50 nmol/L)的OSI-027处理，或以25 nmol/L OSI-027 处理0、24、48、72、96 h后，采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法、细胞集落形成实验观察HT-29细胞的生长增殖情况；应用流式细胞仪(FACS)及台盼蓝染色法检测OSI-027处理后HT-29细胞的凋亡和死亡情况；采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测HT-29细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和细胞色素C(cytochrome C)的表达。结果：OSI-027可抑制HT-29细胞的存活，且呈浓度和时间依赖性；还可抑制HT-29细胞的增殖，呈浓度依赖性；此外，OSI-027还能诱导HT-29细胞的凋亡和死亡，并呈浓度依赖性。OSI-027处理后，HT-29细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C的表达水平上调。结论：新型mTORC1/mTORC2双重抑制剂OSI-027可抑制人结肠癌细胞HT-29的增殖并诱导细胞凋亡。

关键词结肠癌；OSI-027；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；凋亡；信号转导

结肠癌的发病率在我国恶性肿瘤中居第3位，且呈逐年上升趋势[1]。以往常用于结肠癌治疗的奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等药物的不良反应较严重，且易产生耐药性[2]。

研究[3-5]证实，PI3K-Akt-mTOR信号通路在结肠癌等多种实体恶性肿瘤中过度表达及活化。PI3K-Akt-mTOR信号通路可以通过多种机制诱导结肠癌的发生与发展，促进肿瘤细胞的存活、增殖、转移，并抑制细胞凋亡等[3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)信号通路中位于蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)下游的重要分子，有2种复合物mTORC1和mTORC2，参与调节蛋白质合成、细胞周期和细胞增殖。

近年来筛选出的新型mTOR特异性激酶抑制剂OSI-027能阻断mTORC1和mTORC2的活性[6]。本研究旨在观察OSI-027对人结肠癌细胞株HT-29的体外抑制作用。

1资料与方法

1.1材料人结肠癌细胞株HT-29及OSI-027均购自德国Calbiochem公司；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测试剂盒、DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)凋亡试剂盒均购自美国Sigma公司。实验所需的抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人结肠癌细胞株HT-29用含10% FBS的DMEM培养液于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，48 h更换一次培养液，3～4 d传代1次。取对数生长期细胞进行细胞实验。OSI-027以DMSO溶解，后续实验中以等体积的0.1%DMSO作为对照。

1.2.3细胞集落形成实验检测细胞增殖将HT-29细胞接种于6孔板，每组设5个复孔，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中孵育过夜。给予不同浓度的OSI-027(0.1、1、10、25 nmol/L)或等体积DMSO处理8 d后，观察直径>50 μm集落的数目，并与对照组进行比较，实验至少重复3次。细胞增殖率=实验组直径>50 μm集落的数目/对照组直径>50 μm集落的数目×100%。

1.2.4流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡将HT-29细胞接种于6孔板，每组3～4个复孔，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。给予不同浓度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等体积DMSO处理72 h后，采用Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒鉴别细胞凋亡类型，其中，Annexin-V-FITC阳性/PI阴性的细胞为早期凋亡细胞，Annexin-V-FITC阳性/PI阳性的细胞为晚期凋亡细胞，而Annexin-V-FITC阴性/PI阳性的细胞为非凋亡细胞。每个样本至少检测20 000个细胞，实验至少重复3次。计算Annexin-V-FITC阳性细胞的比率，即为凋亡率。

1.2.5台盼蓝染色检测细胞死亡将HT-29细胞接种于6孔板，每组3个复孔，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱培养。给予不同浓度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等体积DMSO处理，72 h后对细胞进行台盼蓝染色，死亡细胞为台盼蓝染色阳性。实验至少重复3次。细胞死亡率=实验组台盼蓝阳性细胞数/对照组总细胞数×100%。

1.2.6蛋白质印迹(Western blotting)法检测HT-29细胞凋亡相关蛋白的表达取培养的HT-29细胞，给予OSI-027(25 nmol/L)或等体积DMSO处理，24、48 h后，用RIPA裂解液提取HT-29细胞总蛋白并用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白浓度。每孔上样30 μg蛋白，用6%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，电转移至硝酸纤维素膜。加入1∶300的cleaved-caspase-3一抗和细胞色素C(cytochrome C)一抗后4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)后室温孵育2 h。显色拍照。

1.3统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料采用单因素方差分析进行比较。P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT法检测结果OSI-027可抑制HT-29细胞的存活，且呈浓度和时间依赖性，见图1~2。

与对照组比较，*P<0.05

图1不同浓度OSI-027(处理72 h)对HT-29细胞

存活率的影响

与对照组比较，*P<0.05

图2OSI-027处理不同时间对HT-29细胞存活率的影响

2.2细胞集落形成实验结果OSI-027可抑制HT-29细胞的增殖，且呈浓度依赖性，见图3。

2.3台盼蓝染色检测结果OSI-027可诱导HT-29细胞的死亡，且呈浓度依赖性，见图4。

2.4流式细胞仪检测结果OSI-027可诱导HT-29细胞的凋亡，且呈浓度依赖性，见图5。

2.5Western blotting法检测结果OSI-027可诱导HT-29细胞凋亡相关蛋白的表达，且呈时间依赖性，见图6。

与对照组比较，*P<0.05

图3不同浓度OSI-027对HT-29细胞增殖率的影响

与对照组比较，*P<0.05

图4不同浓度OSI-027对HT-29细胞死亡率的影响

A：对照组与OSI-027组(药物组)记录细胞凋亡；B：药物组早期凋亡细胞；C：药物组晚期凋亡细胞；与对照组比较，*P<0.05

图5不同浓度OSI-027对HT-29细胞凋亡率的影响

与对照组比较，*P<0.05

图6OSI-027对HT-29细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C表达的影响

3讨论

PI3K-Akt-mTOR信号通路中的mTOR信号分子参与调控能量代谢和细胞增殖；mTOR的2个直接底物，即p70S6K和4E-BP-1是蛋白质生物合成的关键因子[7]。mTOR的异常活化在肿瘤的发生、发展中有重要作用[7]。Ai等[8]研究发现，抑制mTOR能限制肿瘤细胞利用葡萄糖产生能量，阻止肿瘤细胞利用氨基酸合成新的蛋白质，从而抑制肿瘤的生长。最近有研究[9]发现，mTOR抑制剂(rapamycin)可明显减少淋巴瘤和白血病细胞的ATP生成，但Efeyan等[10]发现，通过活化胰岛素受体底物1(IRS-1)可负反馈活化存活通路Akt，抑制rapamycin及其类似物的疗效；而且，rapamycin及其类似物还可负反馈活化的Erk/MAPK通路，进一步限制其疗效[11]。而OSI-027是一种新近研发的mTOR抑制剂，能阻断2种mTOR复合物的活性，常被称为mTORC1/mTORC2双重抑制剂，具有阻滞肿瘤细胞的细胞周期以及诱导其分化和凋亡的能力[12]，从而达到抗肿瘤的效果。

本研究结果显示，外源性添加的mTORC1/mTORC2双重抑制剂OSI-027可诱导结肠癌细胞HT-29的死亡，抑制HT-29细胞的存活和增殖，且其作用与药物浓度及作用时间相关。随着OSI-027浓度的增加及作用时间的增加，对HT-29的细胞毒作用也逐渐增加。OSI-027还同时诱导HT-29细胞凋亡，表现为Annexin V阳性细胞数目显著增加，细胞内cleaved-caspase-3和cytochrome C蛋白的表达水平增加。

OSI-027阻断HT-29细胞mTORC1和mTORC2的组装和活化的机制尚有待于进一步明确。

参考文献

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Inhibitory Effect of Novel mTORC1/mTORC2 Dual Inhibitor OSI-027 on Human Colon Cancer Cell Line HT-29 in Vitro

CHENGuopingCAODachunLIUHailin

DepartmentofGastroenterology,TheNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective： To investigate the inhibitory effect of novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 on human colon cancer cell line HT-29 in vitro.Methods： HT-29 cells, cultured in vitro，were either treated with different concentrations of OSI-027(0.1,1,10,25 and 50 nmol/L),or treated with 25 nmol/L OSI-027 for 0,24,48,72,96 h,respectively. Methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT) and cell colony forming assay were used to detect the growth and proliferation of HT-29 cells after treatment with OSI-027. Flow cytometry(FACS) and trypan blue staining were used to detect the influence of OSI-027 on apoptosis and death of HT-29 cells. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C.Results： OSI-027 inhibited the survival of HT-29 cells, and the inhibition was concentration and time dependent. It also inhibited the proliferation of HT-29 cells, and the inhibition was concentration dependent. It also induced apoptosis and death, and the inducement was concentration dependent.Expression levels of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C increased after OSI-027 treatment. Conclusions： The novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 can inhibit the proliferation of human colon cancer cell HT-29 and induce cell apoptosis.

Key WordsColon cancer；OSI-027；Mammalian target of rapamycin；Apoptosis；Signal transduction

中图分类号R735.3

文献标识码A

通讯作者刘海林，E-mail：liuhailin@medmail.com.cn