正交试验研究枇杷清肺颗粒的醇提工艺

汪海斌, 吴电彩，马　玲,张　毅,陈师农，孙　备，黄顺旺,，宋少江

(1. 安徽中医药大学，安徽 合肥　230031；2.安徽省药物研究所·安徽省中药研究与开发重点实验室，

安徽 合肥　230022；3.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳　110016)



正交试验研究枇杷清肺颗粒的醇提工艺

汪海斌1, 吴电彩1，马玲2,张毅2,陈师农2，孙备2，黄顺旺2,3，宋少江3

(1. 安徽中医药大学，安徽 合肥230031；2.安徽省药物研究所·安徽省中药研究与开发重点实验室，

安徽 合肥230022；3.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳110016)

摘要：目的优选枇杷清肺颗粒的最佳醇提工艺。方法醇提工艺以盐酸小檗碱含量和浸膏得率为指标,采用正交试验优选枇杷清肺颗粒最佳醇提工艺。结果醇提最佳工艺条件为加10倍量70%乙醇,回流提取3次, 每次2 h。结论优选出的提取工艺稳定，主要有效成分转移率高，为枇杷清肺颗粒的成型工艺研究奠定了基础。

关键词：枇杷清肺颗粒；正交试验；高效液相色谱法；盐酸小檗碱

枇杷清肺饮是《外科大成》中的名方，由枇杷叶、黄连、黄柏等六味药材组成。具清肺除痤、解毒散结之功效，用于治疗痤疮、粉刺[1-2]。原方用以汤剂，使用不便，为此，我们将汤剂改为颗粒剂。根据处方中药材所含成分的理化性质，我们对处方中黄连、黄柏、枇杷叶等五味药材进行醇提，以处方中黄连、黄柏药材的主要有效成分盐酸小檗碱含量与干浸膏得率为指标[3]，考察不同浓度乙醇提取效率，优选出最佳乙醇提取浓度；采用正交试验考察醇提时加醇量、回流时间、回流次数对醇提工艺的影响，优选出枇杷清肺颗粒醇提工艺的最佳条件。

1仪器与试药

Waters高效液相色谱仪；Waters-2998紫外检测器；Waters Empower色谱工作站；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AR1140型电子天平(上海加惠仪器仪表有限公司)；真空干燥箱(上海越众仪器设备有限公司)；微压循环中药煎药机(北京东华原医疗设备有限公司)。

枇杷叶、黄连、黄柏等六味药材均购自合肥市乐家老铺中药饮片有限公司，经鉴定符合《中国药典》2010年版相关项下规定。盐酸小檗碱对照品(批号：0713-201212，含量测定用)购自中国药品生物制品检定所，乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2乙醇提取工艺

2.1乙醇浓度考察枇杷清肺颗粒中的枇杷叶、黄连、黄柏等药材所含有效成分大多溶于乙醇，且不易被破坏。首先，对乙醇提取的浓度进行考察。称取药材(285 g)4份，分别加入10倍量不同浓度乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收乙醇至无醇味，浓缩后减压干燥，得干膏，备用。以盐酸小檗碱含量(C20H17NO4·HCl)、浸膏得率为指标，实验结果见表1。根据表1可知，50%的乙醇提取的浸膏得率最高，但其盐酸小檗碱含量不高，而70%的乙醇提取盐酸小檗碱含量最高，干浸膏得率适中，因此，选用70%乙醇作为提取溶剂。

表1　不同乙醇浓度的考察

2.2正交试验设计[4]以盐酸小檗碱、干浸膏率为指标，选择加醇量、回流时间、回流次数三个因素，每因素选取3个水平进行L9(34)正交设计，因素水平见表2。

表2　乙醇提取因素水平表

2.3盐酸小檗碱和干浸膏的提取按表1设计9组试验，根据处方比例取枇杷叶等五味药材285 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加一定量的乙醇，加冷凝管，加热提取，停止加热后，取下冷凝管，将提取液合并，滤过，滤液浓缩至稠浸膏,置恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，60℃减压干燥至完全后,分别测定提取液中盐酸小檗碱含量及干浸膏得率。

2.4盐酸小檗碱含量测定[3]

2.4.1色谱条件与系统适用性试验COSMOSIL 5C18-MS-II柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温为室温；流动相为乙腈：0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液：0.025 mol·L-1十二烷基硫酸钠溶液(50∶25∶25)；检测波长为345 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000。

2.4.2对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL中约含盐酸小檗碱0.1 mg，即得。

2.4.3供试品溶液的制备取本品约1 g，研磨成细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100 ∶1)的混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。见图1~2。

2.5正交试验方法与结果按处方比例取药材(285 g)，试验安排及结果见表3，方差分析见表4。

表3　乙醇提取工艺试验安排及结果

表4　方差分析

由表3、4试验结果方差可以看出，影响干浸膏得率的因素大小顺序为C>A>B，得到最佳工艺条件A3B3C3，影响盐酸小檗碱提取率的因素大小顺序为C>B>A，得到最佳工艺条件A2B3C3。以干浸膏得率为考核指标，因素C对检测指标具有极其显著性影响(P<0.01)，因素A对检测指标具有显著性影响(P<0.05),因素B对检测指标影响不显著(P>0.05)；以盐酸小檗碱提取率为考核指标，因素C对检测指标具有显著性影响(P<0.05)，因素A，B对检测指标影响不显著(P>0.05)。

综合考虑，兼顾干浸膏得率和盐酸小檗碱提取率，确定醇提取最佳工艺为A3B3C3, 即10倍量70%乙醇回流提取3次, 每次2 h，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液备用。

2.6工艺验证取3份药材，将A3B3C3组合平行试验3次，结果见表5。

表5　最佳工艺条件验证结果

上述试验结果显示：三组试验的醇提干膏率平均为17.31%，盐酸小檗碱提取率平均为88.68%，与上述正交试验结果相吻合，证明醇提工艺稳定合理。

3讨论

3.1醇提工艺的选择黄连、黄柏药材中共有的主要有效成分小檗碱对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用[5]。据有关文献报道[6]：小檗碱水煎损失约60%～90%，浓缩再损失50%~60%，致使转移到成品中的数量只有5%左右，而采用乙醇回流提取黄连、黄柏，小檗碱提取率增加到82%，建议：含有黄连或黄柏的中药复方制剂,工艺过程中应采取措施,或将二药单独提取,或避免水提等,以避免盐酸小檗碱的损失,提高成品含量。因此，本处方中黄连、黄柏、枇杷叶等五味药材，我们采用醇提工艺。

3.2正交试验指标的选择本品处方由六味药材组成，其中盐酸小檗碱为清肺除痤的主要有效成分之一，具有良好的醇溶性，其含量可反映醇溶性成分提出效果，因此选用盐酸小檗碱含量作为醇提工艺正交试验的主要考核指标，本品为复方中药制剂，干浸膏得率直接影响到制剂的成型性，因此我们选用干浸膏得率作为醇提工艺的考核指标之一。

3.3含量测定方法的选择有关小檗碱含量测定方法的文献报道[5]有四苯硼钠直接滴定法、酸性染料比色法、一阶导数紫外光谱法、薄层层析—比色法、薄层扫描法、荧光扫描法、高效液相法、流动注射分析法等。我们采用高效液相色谱法测定本制剂中小檗碱的含量，该方法简便、专属、灵敏、重现性好。参考相关文献[3]和试验摸索，流动相选择为乙腈∶0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶0.025 mol·L-1十二烷基硫酸钠溶液(50 ∶25 ∶25)，流速1.0 mL·min-1，结果盐酸小檗碱峰保留时间适中，且分离度良好。

3.4盐酸小檗碱转移率的计算依据中国药典[7]，我们分别对处方中黄连、黄柏药材中盐酸小檗碱的含量进行测定，同时根据处方中黄连、黄柏所占比例，计算出醇提优化工艺得到的干膏中盐酸小檗碱的含量，其转移率稳定在88%左右，转移率高。

本试验通过正交试验设计，得出最佳醇提工艺，经小试验证，中试放大，干膏得率适中，有利于制剂成型，同时，盐酸小檗碱提取率高，确保枇杷清肺颗粒的质量和临床疗效。

参考文献:

[1]张源,黄艳.枇杷清肺饮加减治疗寻常型痤疮135例疗效观察[J].现代医药卫生，2011,27(3)：334-335.

[2]蔡虹,黄桂香,赵雅梅,等.加味枇杷清肺饮治疗马拉色菌毛囊炎作用机理研究[J].当代医学，2012,18(22)：129-130.

[3]李菲,郑国成,孔德宪，等.高效液相色谱法测定连苏胶囊中盐酸小檗碱含量[J].中国药业，2012,21(10)：42-43.

[4]刘定远 主编.医药数理统计方法[M].3版. 北京：人民卫生出版社，2002:135.

[5]郑虎占.中药现代研究与应用(第5卷) [M]. 北京:学苑出版社，1998：4354,4671.

[6]魏刚,黄月纯.盐酸小檗碱在中药制剂中的动态变化和含量分析[J].中国实验方剂学杂志,2000,6(4):61-62.

[7]国家药典委员会.中国药典:(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010:285-286.

Study on ethanol process for extraction of

Pipa Qingfei granules by orthogonal test

WANG Hai-bin1, WU Dian-cai1, MA Ling2,et al

(1.AnhuiUniversityofTCM，Hefei230031China; 2.AnhuiInstituteofMateriaMedica,

AnhuiProvincialKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,Hefei,Anhui230022China)

Abstract：Objective To optimize the ethanol extracting process of Pipa Qingfei granules.Methods The obtaining rate of extraction and the content of the berberine were taken as indexes for the ethanol extraction process. The ethanol extraction process of Pipa Qingfei granules was optimized by orthogonal design.Results The optimal conditions for the ethanol extraction of Pipa Qingfei granules were using 10 times of 70% ethanol solution, reflux three times, 2 hours each time.Conclusion The optimal ethanol extracting method was stable, active ingredient had a high rate of transfer, and it could provide a basis for molding technology of Pipa Qingfei granules．

Key words：Pipa Qingfei granules；orthogonal test；HPLC；berberine

(收稿日期：2014-08-20，修回日期：2014-10-09)

通信作者：黄顺旺，男，副主任药师，研究方向：新药研究与开发，E-mail：huangsw5503@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.005