高效液相荧光法测定人尿液中儿茶酚胺含量

成利娟，黄　燕，许杜娟，，宋礼华，夏　泉，韩卫星，杜俊华

(1.安徽医科大学药学院，安徽 合肥　230032；2.安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥　230022；

3.安徽安科生物工程(集团)股份有限公司，安徽 合肥　230088；4.安徽医科大学第一附属医院心内科；

5.安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，安徽 合肥　230022)



高效液相荧光法测定人尿液中儿茶酚胺含量

成利娟1，黄燕2，许杜娟1，2，宋礼华3，夏泉2，韩卫星4，杜俊华5

(1.安徽医科大学药学院，安徽 合肥230032；2.安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥230022；

3.安徽安科生物工程(集团)股份有限公司，安徽 合肥230088；4.安徽医科大学第一附属医院心内科；

5.安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，安徽 合肥230022)

摘要：目的建立高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FD)法同时测定人尿液中儿茶酚胺(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺)含量，用于嗜铬细胞瘤的诊断。方法自制活性氧化铝，在弱碱性Tris缓冲液条件下吸附尿液样本中儿茶酚胺，使用 ZORBAX-SB (4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱，以甲醇-20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相；流速：0.8 mL·min-1，柱温25℃；激发波长(EX)为286 nm，检测波长(EM)为318 nm。 结果重酒石酸去甲肾上腺素、肾上腺素、盐酸多巴胺在1.56～1 000 μg·L-1浓度范围内线性关系良好(r=0.999 5、0.999 7、0.999 8)；日内及日间精密度RSD在0.31%～8.02%之间；高、中、低三个浓度的平均方法回收率在94.22%～108.69%之间。 结论该方法准确，稳定性较好，线性范围广，为嗜铬细胞瘤的诊断及围手术期治疗提供依据。

关键词：儿茶酚胺；尿液；高效液相荧光检测法；活性氧化铝

机体内儿茶酚胺类化合物(Catecholamines, CAs)主要包括去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、肾上腺素(epinephrine, E)、多巴胺(Dopamine, DA)。NE、E、DA是体内重要的信息传递物质，可由肾上腺髓质嗜铬细胞以及交感神经节处嗜铬组织分泌，正常量的儿茶酚胺在维持机体多种生理功能平衡中起着极其重要的作用。而嗜铬细胞瘤(pheoehromocytoma, PHEO)是一种大量分泌CAs的肿瘤，其患病率约为0.002%~0.008%，占高血压患者的0.1%~0.5%[1]。PHEO患者体内儿茶酚胺含量的过度增加可导致心血管、内分泌、消化道等多系统并发症，该类疾病因其临床表现的多样性及混杂性而具有很强的欺骗性，极容易导致漏诊、误诊[2-3]；而其严重的心血管并发症可危及生命，有文献报道尸检中发现PHEO的患病率可达0.05%，而在这0.05%的患者中有50%的死亡直接归因于PHEO[4]。但该类肿瘤以良性为主，确诊后可行手术切除，各系统并发症随之消失，因此，及时的诊断尤为重要[5]。本文建立的HPLC-FD 测定人尿液中儿茶酚胺, 方法简单、快速、专一, 适用于临床测定，为嗜铬细胞瘤的鉴别诊断提供可靠的依据。

1仪器和试剂

1.1仪器高效液相色谱仪：Waters e2695 配备Waters e2475 荧光检测器；FA2104电子天平(上海天平仪器厂)；25BT S电子天平(德国塞多利斯)；离心机(DL-5低速大容量离心机)；XW-80A 涡旋振荡器(上海医科大学仪器厂)；HH数显恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；-40℃超低温冰箱270L(美菱),氮吹仪(EYELA MG-2200)；4℃海尔冷藏柜(BC/BD-388A型)。

1.2试剂重酒石酸去甲肾上腺素(NE，中国药品生物制品检定所，批号：100169-201103)、肾上腺素(E，中国药品生物制品检定所，批号：100154-201104)、盐酸多巴胺(DA，中国药品生物制品检定所，批号：100070-201006)；盐酸异丙肾上腺素(IP，中国药品生物制品检定所，批号：100166-201004)；甲醇(色谱纯，Tedia公司)；盐酸、醋酸、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)均为分析纯；灭菌注射用水。

1.3检测样本正常人、非嗜铬细胞瘤高血压患者、嗜铬细胞瘤患者的24 h尿液。

2方法与结果

2.1色谱条件[6]色谱柱：ZORBAX-SB (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(含EDTA-2Na 0.2 mol·L-1)=2 ∶98；流速：0.8 mL·min-1；激发波长(EX)为286 nm，检测波长(EM)为318 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，重酒石酸去甲肾上腺素、肾上腺素、盐酸多巴胺、盐酸异丙肾上腺素出峰时间分别在3.4、4.6、7.8 、19.5 min，系统适应性均符合要求，NE、E、DA分离度分别为：1.71， 3.05，4.73；NE、E、DA拖尾因子分别为：1.57，1.14，1.02；NE、E、DA理论塔板数分别为2 359，1 672，2 616,色谱峰见图1。

2.2重酒石酸去甲肾上腺素、肾上腺素、盐酸多巴胺混合贮备液及内标液的配制精密称取重酒石酸去甲肾上腺素、肾上腺素、盐酸多巴胺对照品适量，用0.2 mol·L-1醋酸溶液配制混合贮备液，浓度为10 mg·L-1，用1.5 mL离心管分装，于-40℃超低温冰箱内避光保存，临用时4℃解冻，用灭菌注射用水稀释成所需浓度的工作液。

精密称取盐酸异丙肾上腺素适量，用0.2 mol·L-1醋酸溶液配制成10 mg·L-1的贮备液，用1.5 mL离心管分装，于-40℃超低温冰箱内避光保存，临用时4℃解冻，用灭菌注射用水稀释成所需浓度。

2.3活性氧化铝的制备[6]称取20 g氧化铝，加入100 mL(2 mol·L-1)盐酸，100℃条件下，快速搅动45 min，70℃条件下，用50 mL盐酸(2 mol·L-1)洗涤15 min，2次；于50℃下用100 mL盐酸(2 mol·L-1)洗涤1次，15 min，然后用总量为2 000 mL的灭菌注射用水洗涤多次(约30次)，至中性，倾去剩余水分，用滤纸将氧化铝吸干，于350℃，4 h，自然冷却后置干燥器皿内保存备用。

2.41 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)溶液配制称取30.275 mg Tris、0.25 g EDTA于烧杯中，灭菌注射用水溶解，6 mol·L-1的盐酸调节pH至8.50，于250 mL的容量瓶中用灭菌注射用水定容至刻度。

2.5样品处理[7]分别吸取尿液1 mL于15 mL带盖离心管中，取10 μg·L-1盐酸异丙肾上腺素(内标)贮备液10 μL加入尿液中，涡旋混匀。用灭菌注射用水稀释4倍，加入2 mL 1 mol·L-1Tris-EDTA溶液(含EDTA 0.1%)加入活化的氧化铝20 mg,振荡5 min,离心3 000 r×10 min，弃上清液并用滤纸吸尽离心管管壁上液相。加入4 mL灭菌注射用水洗涤，振荡5 min, 离心3 000 r×10 min，弃上清并用滤纸吸尽液相。加入2 mL甲醇洗涤，振荡5 min, 离心3 000 r×10 min，弃上清并用滤纸吸尽管壁液相，氮吹5 min。加入0.2 mol·L-1的HCl 100 μL,漩涡振荡2 min, 离心3 000 r×10 min。按上述色谱条件，取上清液20 μL进样。

2.6专属性考察对不同正常个体(n=6)尿液样本，在该方法下色谱图各组分保留时间保持一致。NE、E、DA、IP保留时间分别为3.4、4.6、7.8、19.5 min。

对正常人尿液，空白尿液，空白尿液+混合标准品+内标，嗜铬细胞瘤患者尿液样本按上述处理方法及色谱条件，取上清液20 μL进样，如图B显示NE、E、DA、IP保留时间处均无干扰。各色谱峰分离度均大于1.5，符合要求。不同样本色谱图见图1。

2.7标准曲线绘制于健康人空白尿液中分别精密加入NE、E、DA混合标准品系列工作液(浓度为15.625、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000 μg·L-1)，按“2.5”项下操作。浓度相当于1.5625、12.5、25、50、100、200、400、800、1 000 μg·L-1。最终以内标法定量，按“2.5”项下操作，均加入10 μg·L-1盐酸异丙肾上腺素(内标贮备液)10 μL。以样品峰面积对内标峰面积之比(R)为纵坐标，NE、E、DA混合标准品系列工作液浓度(C)为横坐标，分别得方程RNE=0.011 3C+0.204 4，r=0.999 5;RE=0.0138C-0.0159，r=0.9997;RDA=0.019 9C+1.510 3，r=0.999 8。NE、E、DA在1.56～1 000 μg·L-1浓度范围内线性关系良好。

注：A.正常人尿液对照；B.空白尿液对照；C.空白尿液+混合标准品+内标；D.嗜铬细胞瘤患者样本；1.NE；2.E；3.DA；4.IP；注：空白尿液的制备:按本文叙述氧化铝吸附法，对同一份尿液反复吸附5次，除去尿液中本身含有的NE，E，DA作为空白尿液。

2.8回收率和精密度试验于1 mL空白尿液中分别精密加入NE、E、DA混合标准品系列工作液(浓度为125、1 000、8 000、10 000 μg·L-1)，按“2.5”项下操作。每个浓度各分别平行检测(n=3)。三者的日内及日间精密度的RSD均小于9.00%，三个浓度方法回收率在94.22%～108.69%之间，该方法符合生物样品分析要求，结果见表1。

±s)

2.9稳定性试验配制12.50、100.00和800.00 μg·L-1三个浓度的尿液样品于-40℃冰箱中保存，反复冻融0次,1次,2次,3次，冷冻0、5、10、20、30 d后，按“2.5”项下处理，考察样品在-40℃条件保存的稳定性(n=5)，结果表明，样品反复冻融3次、于-40℃冰箱中保存30 d仍能保持稳定，RSD均小于10%，见表2。

2.10样品测定本研究选取2013年3月至2014年2月于某三甲医院因阵发性或持续性高血压、心慌、头痛、出汗等症状就诊的患者为研究对象，收集24 h尿液，检测NE、E、DA含量。其中发现NE显著升高(正常人高值的2~5倍)者8例(男性5例，女性3例)，并经术后病理检查8例均确认为嗜铬细胞瘤，作为嗜铬细胞瘤组；性别、年龄(年龄±3岁)匹配的高血压且排除嗜铬细胞瘤的患者160例,作为高血压对照组；性别、年龄(年龄±3岁)匹配的正常人64例作为正常对照组。计量资料用均数±标准差表示，采用t检验(所有统计分析均使用SPSS13.0 统计软件；P<0.05 为差异有统计学意义)，结果见表3。

表2　样品反复冻融及30 d冷冻稳定性试验

由表3可知，该方法用于嗜铬细胞瘤的诊断，发现8例患者24 h尿液NE含量显著高于正常人及非嗜铬细胞瘤高血压人群，诊断为嗜铬细胞瘤，并经病理检查证实。该8例嗜铬细胞瘤患者均属于大量分泌NE的分泌类型，且都是单侧肾上腺发病，瘤体平均大小为4.9 cm×4.6 cm×2.5 cm。术后第二天起24 h尿NE、E含量明显下降，与正常组比较无统计学差异，头痛、心慌、呕吐等症状消失，血压恢复正常。

表3　各组24 h尿液NE、E、DA含量

注：★与正常对照组比较，P<0.05 ；△嗜铬细胞瘤组与高血压对照组比较，P<0.05。

3讨论

3.1HPLC-FD检测人体尿液儿茶酚胺方法学评价及注意事项本文建立的儿茶酚胺检测方法的核心是HPLC-FD及经典的氧化铝吸附法。尿液样品经自制的活性氧化铝吸附，通过简单的试剂(灭菌注射用水、甲醇)洗涤，盐酸洗脱即可进样测定，与已报道的柱前衍生化、阳离子萃取柱、液—质联用等检测方法[8-9]相比，具有以下特点：操作过程简单、快速；所用试剂及材料经济易配备，成本低；样本留取对患者无损伤。综上得该方法适合基层医院开展，临床实用性强。

本文采用1 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)缓冲液来提高活性氧化铝的吸附能力，经过试验发现缓冲液酸碱度(pH)在8.45～8.65范围内氧化铝吸附效果良好，当1 mol·L-1Tris(0.1%EDTA)缓冲液pH调制8.70及以上时NE、E、DA处均不出峰。很可能是因为儿茶酚胺在pH≥8.70的碱性条件不稳定，转化成无荧光的其他产物。NE、E、DA结构中均含有两个酚羟基，对光、热、碱、氧化剂均不稳定，因此样本收集时除需浓盐酸防腐外还须低温，避光放置。样品处理及检测等整个实验要连续、快速，操作过程尽量做到低温、避强光照射。

3.2尿液儿茶酚胺含量测定在嗜铬细胞瘤患者诊断中的重要作用儿茶酚胺类物质属于生物碱，既是细胞体内非常重要的神经递质，也是重要的激素物质，在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏等组织系统的生理活动中起着广泛的调节作用，直接影响人体的代谢水平。嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、高血压、帕金森病、抑郁症等都会导致儿茶酚胺类物质的代谢异常。其中儿茶酚胺的检测在嗜铬细胞瘤的诊断中灵敏度及特异性极高[10]。而较之脑脊液、血液等生物样品，尿液中儿茶酚胺较高，无需较高倍数的富集，只需去除样品中的杂质即可。本文所建立方法临床适用性强，及时的检测对嗜铬细胞瘤患者的及早诊断，降低突发心血管意外事件的风险具有极其重要的意义，同时对儿茶酚胺代谢异常性疾病的诊断和致病机制的探究有指导作用。

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Determination of catecholamines concentrations in human urine

by high performance liquid chromatography-fluorimetric detection

CHENG Li-juan1, HUANG Yan2, XU Du-juan1,2,et al

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.DepartmentofPharmacy,

theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method based on high performance liquid chromatography-fluorimetric detection to determine the concentrations of catecholamines (norepinephrine, epinephrine and Dopamine) in human urine for diagnosis of pheochromocytoma.MethodsThe catecholamines in human urine samples were adsorbed by homemade activated alumina with Tris-buffer under alkaline conditions, using internal standard method for the determination of their concentrations. Separation was performed on a ZORBAX-SB (4.6 mm× 250 mm, 5 μm) colum. The mobile phase was consist of methanol-20 mmol·L-1potassium dihydrogen phosphate with flow rate of 0.8 mL·min-1, column temperature: 25 ℃. The fluorescence intensity was measured at the excitation wavelengths of 286 nm and the emission wavelengths of 318 nm.ResultsThe linear relationships were good within 1.56～1 000 μg·L-1for norepinephrine bitartrate, epinephrine hydrochloride, and dopamine hydrochloride (r=0.999 5, 0.999 7, 0.999 8); The intra-and inter-day coefficients of variation were between 0.31% and 8.02%; the mean analytical recoveries of high, medium and low concentrations were in the range of 94.22% to 108.69%.ConclusionThe method is accurate, stable, and shows wide linear range, which can provide a basis for the corresponding disease diagnosis and Perioperative treatment.

Key words:catecholamines; urine; high performance liquid chromatography-fluorimetric detection; activated alumina

(收稿日期：2014-03-11，修回稿：2014-07-09)

通信作者：许杜娟，女，主任药师，硕士生导师，研究方向：肿瘤药理学和临床药学，E-mail：Xudujuan6365@163.com

作者简介：成利娟，女，硕士研究生

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.016