土壤水分对新鲜和采后干燥丹参根中活性成分含量的影响

王　微，周国军，李　焱，周铜水

(复旦大学生命科学学院及天然药物研究中心，上海　200438)



土壤水分对新鲜和采后干燥丹参根中活性成分含量的影响

王微，周国军，李焱，周铜水

(复旦大学生命科学学院及天然药物研究中心，上海200438)

摘要：目的进一步验证丹参药材中丹酚酸类成分尤其是丹酚酸B是采后干燥的产物；了解栽培过程中土壤水分状态对新鲜和阴干后丹参药材中丹酚酸类和丹参酮类成分的影响。方法采用高效液相色谱法测定了不同土壤水分条件栽培的新鲜和采后阴干丹参样品中 6 种酚酸类和4种丹参酮类成分的含量。结果新鲜丹参样品中，均含有较高含量丹参酮类成分，但只有极度干旱胁迫时(土壤水势<30% )，才可检测到丹酚酸B(<1%)，且无其他酚酸类成分。阴干样品中丹酚酸类成分含量均显著增加，其中丹酚酸B含量达 4.2%；丹参酮类成分也增加了 30%以上。阴干后丹参中丹酚酸B及总酚酸含量与栽培过程中土壤水势呈现显著负相关。结论采后干燥有利于丹参中活性成分积累。丹参药材中丹酚酸类成分尤其是丹酚酸B是栽培和采后极度干旱(干燥)的产物，栽培过程中适度的干旱胁迫有利于药材中酚酸类成分的产生。

关键词：丹参；土壤水分；采后干燥；丹酚酸类和丹参酮类成分；HPLC

丹参(SlaviamiltiorrhizaBge)为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，药用干燥根茎。主要产于山东、安徽、河北和陕西等地。具有活血调经、祛瘀止痛、养心除烦等功效，用于治疗心血管疾病及糖尿病疗效显著[1-2]。丹参中活性成分主要分为两类：以丹酚酸B为主的水溶性酚酸类成分，如原儿茶酸(PA)、原儿茶醛(PD)、丹参素(DSS)、咖啡酸(CA)、紫草酸(lLA)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸A(SaA)、丹酚酸B(SaB) 和丹酚酸C(SaC) 等；以丹参酮Ⅱa为主的脂溶性丹参酮类成分, 如隐丹参酮(cTN)、二氢丹参酮Ⅰ(dTNI)、丹参酮Ⅰ(TNI)、丹参酮Ⅱa(TNⅡa) 等[3-4]。中国药典(2010 版)规定丹参药材含水量应低于13.0% ，丹酚酸B含量应不低于3.0% ，丹参酮Ⅱa含量应不低于0.2%[5]。

本实验室先前研究表明，丹参的主要水溶性活性成分丹酚酸B是采后干燥过程中产生的，而在新鲜的丹参中含量甚微(<0.1%)[6-8]。但是国内的一些研究报道，丹酚酸B含量在“新鲜”丹参药材中已达到较高水平(>3%)[9-10]。但这些报道均未对“新鲜”丹参样品中的水分含量进行测定。本实验采用不同土壤水分条件进行丹参栽培，用 HPLC 方法测定了新鲜和阴干后丹参根中丹酚酸和丹参酮类成分含量变化的动态，为进一步证实我们前期的实验结果提供新的可靠证据。

1仪器与材料

Agilent 1100系列高效液相色谱仪；Kinetex C18100A色谱柱(美国Agilent公司)；水势仪TEN-g45(上海沪粤明科学仪器有限公司)。水为自制双蒸水；色谱纯乙腈购自德国Merck公司；其余均为分析纯国产试剂。BP110S型电子天平(北京赛多利斯天平公司)。对照品DSS、RA、LA、SaA、SaB、SaC、dTNI、cTN、TNⅡa和TNI(上海友思生物科技有限公司)。一年生丹参幼苗于 2013 年 4 月 20 日购自山东临朐县。

2实验方法

2.1栽培试验方法将丹参幼苗植入高 20 cm、上口径 21 cm、下口径 12 cm的塑料盆，每盆 1 株，内置约 1.8 kg的盆栽土(黑土、蛭石、珍珠岩，三者的体积比为 9 ∶3 ∶1)，放于温室中进行盆栽。于每日下午 5时定量补水 250 mL。盆栽至 8 月，从预栽的 300 盆中挑选出长势优良、大小基本一致的 150 盆进行分组处理，平均分为高水分组、中水分组和低水分组。高水分组继续于每日下午 5时定量补水 250 mL，中水分组每隔 3 d定量补水 250 mL，低水分组每隔 5 d定量补水 250 mL。高水分组土壤含水量维持在(95±2)%；中水分组土壤含水量维持在(74±3)%；低水分组土壤含水量维持在(64±4)%，分组培育 2 个月后，统一停止补水，进行连续自然干旱，并分别于实验开始当天和第 4、第 7、第 12天上午 9 时测量土壤水势并进行随机取样。新鲜丹参根样品去除泥沙、洗净，将一部分新鲜样品经液氮冷冻后粉碎，粉末于 -20℃保存待测；另一部分以整株状态室内阴干 20 d，阴干样品粉碎后于-20℃保存待测。

2.2土壤水势测定按土壤水势测定仪说明书进行测定。土壤水势仪克力管中注满水后，将土壤水势仪陶瓷探头插入土壤中，当被测土壤的水势与张力计存在压力差时，张力计中的水渗入被测土壤直至达到平衡状态，此时压力表所显示的值即为被测土壤的土壤水势。

2.3丹参样品水分含量测定实验参考《中国药典》2010 版中烘干法进行水分含量测定[7]，具体如下：将待测样品置于干燥至恒重且精密称重的培养皿，精密称量初始重量，置于干燥器中，100～105℃干燥 5 h，冷却 0.5 h后精密称重，相同条件下，重复干燥、冷却、称重，直至前后两次重量差异低于 5 mg，即恒重为止。根据损失的重量计算样品的水分含量。每份样品重复 3 次。

2.4化学成分含量测定化学成分含量测定方法参照文献报道[10]。各化合物的线性回归方程分别为DSS：Y=6.41X + 1.38；RA：Y=3.62X + 4.35； LA：Y=3.85X + 4.42； SaA：Y=16.00X + 13.26；SaB：Y=4.70X + 8.70； SaC：Y=1.95X-1.65； dTNI：Y=27.94X + 35.00； cTN：Y=19.70X+88.18； TNI：Y=24.88X + 13.06； TNⅡa：Y=35.95X + 102.22。相关系数r值均大于 0.999，线性范围(μg·g-1)依次为DSS：0.92～230、RA：1.60～400、LA：1.64～410、SaA：1.36～340、SaB：3.40～850、SaC：2.64～330、dTNI：0.96～240、cTN：2.04～255、TNI：0.27～68、TNIIa：1.12～210。对方法进行重复性、精密度、稳定性和加样回收率等测定，实验结果显示RSD值均小于 5%，表明方法稳定、可行，可用于丹参药材的质量控制。

2.5样品含量测定取新鲜和阴干丹参根样品，根据样品制备方法和色谱条件对丹参成分进行测定，通过外标法计算每克样品的成分含量。试样中各成分含量扣去各样品水分含量后求得干重含量。每份样品重复实验 3 次。

2.6数据分析所有数据均有三个独立重复，图表中的数据均表现为平均值±标准差，利用SPSS13.0软件进行数据间显著性，相关性与回归分析。

3结果

3.1栽培过程中各实验组土壤水势变化栽培丹参三个实验组，干旱实验开始时和持续干旱过程中土壤水势变化动态如图1所示。结果表明在连续 12 d干旱胁迫过程中，三个实验组土壤水分含量均呈持续下降趋势：高水分组土壤水势由 95%±2.0% 下降到 59%±3.2%；中水分组土壤水势由 74%±3.1% 下降到 40%±2.5%；低水分组土壤水势由 64%±3.8% 下降到 26%±1.1%。 统计分析表明三组之间水势呈明显差异(P<0.05)。

3.2新鲜丹参根中活性成分的含量实验结果表明，高水分组与中水分组在 12 d的连续干旱过程中，丹参根中均未见任何丹酚酸类成分。低水分组只有在第 7 和第 12天才出现SaB，但仍未检测到其他酚酸类成分(图2)。低水分组第 7天SaB含量为 (3.26±0.26)mg·g-1，第12天为(9.84±0.43)mg·g-1。

不同土壤水分条件栽培过程中，均有较高含量丹参酮类成分(图2)。dTNI、cTN、TNI和TNIIa的含量分别为(0.18±0.05)～(0.37±0.02)、(0.23±0.02)～(0.51±0.1)、(0.07±0.03)～(0.44±0.04)和(0.27±0.06)～(0.59±0.05)mg·g-1，四种成分总酮(TT)含量为(0.82±0.08)～(1.68±0.25)mg·g-1(图3A-E)。

注：*P<0.05；**P<0.01)

注：a: 高水分组；b: 中水分组；c: 低水分组。4: SaB；7: dTNI；8: cTN；9:TNI；10: TNIIa。

注：dTNI：二氢丹参酮Ⅰ，cTN：隐丹参酮，TNI：丹参酮Ⅰ，TNIIa：丹参酮ⅡA；TT：总酮。

3.3阴干后丹参根中活性成分含量。将不同实验组不同时间所取丹参根样品经相同阴干处理。阴干以后，丹参样本中含水量达到药典的标准(<13%)[7]。SaB的含量显著增加，并且在连续 12 d的干旱胁迫过程中，三实验组丹参样品中SaB含量均呈持续上升趋势(图4A)。三组样品中的SaB含量始终保持低水分组最高，高水分组最低。其中高水分组干旱 0天(即参照组) 的SaB含量最低为(5.66±0.32)mg·g-1；低水分组第12天SaB含量最高为(39.76±0.04)mg·g-1，达到药典规定的 3.0%[7]，是高水分组的 6.99 倍。显著性分析结果表明，高水分组与低水分组SaB含量差异均极显著(P<0.01)，高水分组与中水分组SaB含量差异在干旱第 0天和第12天也达到极显著水平(P<0.01)。相关性分析结果显示，阴干丹参样品中SaB含量与栽培过程中土壤水势呈显著负相关(P<0.05)。

阴干的丹参样品中其他丹酚酸类成分含量如图4B～F所示。除SaB外，在三个实验组的新鲜样品中均检测不到其他酚酸类成分。但经过阴干处理后，酚酸类成分均显著增加。DSS含量为(0.06±0.01)～(0.97±0.01)mg·g-1；LA含量为(1.17±0.01)～(2.03±0.05)mg·g-1； RA含量为(1.61±0.12)～(1.92±0.22)mg·g-1；SaA含量为(0.14±0.03)～(0.20±0.02)mg·g-1；SaB含量为(5.66±0.32)～(39.76±0.04)mg·g-1；SaC含量为(0. 82±0.12)～(1.22±0.04)mg·g-1。除SaB外其他酚酸类成分组内和组间变化趋势不明显，差异不显著。总酚酸含量亦显著增加，并且在连续12 d的干旱胁迫过程中，三实验组丹参样品中总酚酸含量如图4G所示，均呈持续上升趋势。三组样品中的总酚酸含量始终保持低水分组最高，高水分组最低。其中高水分组取样 0天的总酚酸含量最低,为(10.36±0.50)mg·g-1；低水分组第12天总酚酸含量最高,为(46.11±1.26)mg·g-1,是高水分组的 4.45 倍。显著性分析结果表明，高水分组与中、低水分组总酚酸含量差异均达到显著水平(P<0.05)。相关性分析结果显示，阴干丹参样品中总酚酸含量与栽培过程中土壤水势呈显著负相关(P<0.05)。

经过阴干处理后，丹参酮类成分显著增加(图3F～J)，四种丹参酮类成分含量均显著高于新鲜丹参根中的含量。dTNI、cTN、TNI和TNIIa的含量分别为(0.33±0.05)～(0.46±0.09)、(0.46±0.09)～(0.92±0.05)、 (0.31±0.05)～(0.51±0.03)和(0.41±0.08)～(0.77±0.09)mg·g-1，四种成分总酮(TT)含量为(1.8±0.24)～(2.38±0.31)mg·g-1(图3F～J)。阴干后TNⅡa含量最高值是新鲜样品的1.31倍，阴干后总酮含量最高值是新鲜样品的1.41倍。

注：RA：迷迭香酸，LA：紫草酸，SaB：丹酚酸B，SaA：丹酚酸A，SaC：丹酚酸C；TP：总酚酸；*P<0.05；**P<0.01。

4讨论

本实验研究结果表明，不同水分条件栽培下，丹参根中均有较高含量的丹参酮类成分；土壤水分含量为60%～90% 的高水分和40%～50%的轻度干旱栽培的新鲜丹参根中并无丹酚酸类成分产生。只有在极度干旱胁迫(土壤水势<30% )时，新鲜丹参根中才可检测到SaB(<1%)。阴干后含水量降低到 13% 左右时，丹酚酸类成分( DSS、LA、RA、SaA、SaB和SaC )含量显著增加，其中SaB含量增加最显著，增加约4倍；丹参酮类成分也显著增加，增加30%以上。此外我们发现阴干后丹参根中丹酚酸B含量与栽培过程中土壤水势呈现显著负相关性。也就是说在栽培过程中，受到干旱胁迫程度越强，采收干燥后样品中SaB含量越高。但是长期极度干旱可能影响植株长势及生物量。所以在生产实践中，应将有效成分含量与植株长势和生物量综合考虑，找到既不影响根生物量又有利于丹酚酸B积累的最适栽培条件。

以上事实说明采后干燥有利于丹参活性成分积累，也进一步说明丹参药材中丹酚酸类成分尤其是丹酚酸B是栽培和采后极度干旱(干燥)的产物，且栽培过程中适度的干旱胁迫有利于丹参药材中酚酸类成分的产生。因此，优化丹参的栽培管理和采后干燥工艺对于提升丹参药材质量和稳定性，以及丹参的GAP生产，具有至关重要的意义，值得深入研究探讨。

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Effect of soil moisture on contents of bioactive components

in fresh and dried roots ofSalviamiltiorrhizaBage

WANG Wei, ZHOU Guo-jun, LI Yan,et al

(ResearchCenterofNaturalProducts,CollegeofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Abstract:Objective To verify our previous findings that salvianolic acids(SAs), especially salvianolic acid B(SaB), in roots of Salvia miltiorrhiza Bge(Danshen), were the post-harvest drying induced products; and to learn the effect of soil moisture during cultivation on contents of 6 SAs and 4 tanshinones in fresh and dried materials.Method The contents of 6 SAs and 4 tanshinones in fresh and dried samples were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results No SAs were detectable in fresh samples when soil moisture in the range of 30%～95%; whereas SaB was found in samples cultivated in extremely drought soil(moisture <30%). Tanshinones components still remain at higher levels in fresh samples. But they increased significantly after drying, especially，the SaB content reached 4.2%. Tanshinones components also increased by more than 30%. The contents of SaB and SAs in the drying roots showed a significant negative correlation with soil water potential during planting.Conclusion Post-harvest drying is conducive to the accumulation of bioactive components. All SAs in Danshen were the post-harvest drying induced products. An appropriate drought stress during cultivation is beneficial for the raise of SAs in the herb Danshen.

Key words:SalviamiltiorrhizaBge; soil moisture; post-harvest drying; salvianolic acids; tanshinones; HPLC

(收稿日期：2014-05-11，修回日期：2014-08-21)

通信作者：周铜水，男，副教授，博士生导师，研究方向：生药学，E-mail: tszhou@fudan.edu.cn

作者简介：王微，女，硕士研究生

基金项目：国家自然科学基金(No 3073883，No 81274075)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.013