miR-126抑制结肠癌增殖及侵袭转移的功能研究

郭叶青，曾凡军，赵必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊晓琦,孟丽霞

(湖北省宜昌市中心人民医院&三峡大学第一临床医学院，湖北 宜昌　443003)



miR-126抑制结肠癌增殖及侵袭转移的功能研究

郭叶青，曾凡军，赵必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊晓琦,孟丽霞

(湖北省宜昌市中心人民医院&三峡大学第一临床医学院，湖北 宜昌443003)

摘要：目的研究miR-126在体内是否具有抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移的功能。方法利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-126的结肠癌细胞系HCT116，将实验组及对照组细胞分别进行裸鼠皮下及尾静脉成瘤体内实验。结果成功构建稳定过表达miR-126细胞系HCT116；裸鼠皮下成瘤实验结果显示过表达miR-126实验组皮下移植瘤瘤体平均体积明显小于其对照组瘤体体积(P<0.05)；尾静脉成瘤组中稳定过表达miR-126实验组肺部转移灶的平均数目、面积均明显小于其对照组(P<0.05)。结论裸鼠移植瘤实验证实miR-126在体内具有抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移的作用。

关键词：miR-126；结肠癌；慢病毒；增殖；侵袭转移

结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内每年大约新发100万结肠癌患者，并且有50余万患者因之而死亡。早期结肠癌病人通过手术治疗预后较好，但是晚期病人的5年生存率仅有20%左右，治疗效果不佳，其死亡的主要原因是肿瘤的转移[1]。结肠癌的转移机制非常复杂，这一过程涉及癌细胞的上皮—间质转换、侵袭黏附能力、血管生成、胞外基质降解以及微环境趋化作用[2-3]。microRNA(miRNA)是长度约为19~24个核苷酸的一类内源性小分子非编码RNA，参与了基因转录后水平的调控。其作用机制是通过与靶mRNA 3’端非翻译区(3’untranslational region，3’UTR)完全或不完全的互补结合，使靶mRNA直接发生降解或者抑制其翻译，从而负调控靶基因的表达[4]。

已有大量研究证实miR-126是肿瘤增殖及转移抑制基因[5-6]，为了研究miR-126在体内是否具有抑制结肠癌增殖、侵袭转移的作用，本研究利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-126的结肠癌细胞系HCT116，进行裸鼠皮下、尾静脉成瘤等体内实验，研究miR-126在体内是否能抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移。

1材料和方法

1.1材料慢病毒过表达载体pGIPZ、慢病毒膜蛋白表达质粒pLTR-G、慢病毒包装质粒pCD/NL-BH，均购买于Addgene公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、质粒抽提试剂盒购自Invitrogen公司；U6 and hsa-mir-126 snRNA Realtime PCR试剂盒购自上海吉玛公司；基因合成及测序由上海生工生物公司完成；人结肠癌HCT116细胞系购自中科院上海细胞库；实验用裸鼠购自长沙斯莱克斯公司，为4周龄雄性裸鼠，SPF级，许可证号：SCXK(湘)2013-0004。

1.2方法

1.2.1稳定过表达miR-126结肠癌细胞系HCT116的构建自miRBase中找到hsa-miR-126序列，在Primer 引物设计软件中将该段序列向上游、下游延伸大约100 bp设计PCR引物，并于末端引入保护碱基、Xho I 、BamH I酶切位点，序列如下：Hsa-miR-126-Xho I-F：CAACAGAAGGCTCGAGGGCAGGTTGCCCGGAGC;Hsa-miR-126-BamH I-R： ATTCTGATCAGGATCCCGCCTAAGTACGTCGGGGC。

以人的正常gNDA为模板， hsa-miR-126-BamH Ι-R、hsa-miR-126-Xho Ι-F为引物，扩增has-miR-126的前体pre-miR-126序列，胶回收PCR产物。用BamH I、Xho I对过表达载体pGIPZ进行酶切，将pre-miR-126序列连接入过表达载体pGIPZ，转化Dh5a感受态，挑取克隆进行菌落的PCR鉴定，接种阳性的克隆。华大基因公司测序结果证实插入的序列为pre-miR-126序列，接种并抽提质粒。抽提质粒后利用293T细胞进行慢病毒的包装，收集病毒液进行浓缩、滴度测定。然后将包装好的稳定过表达miR-126实验组及对照组慢病毒感染HCT116细胞，流式细胞仪筛选纯化GFP阳性的被感染结肠癌细胞，即得到稳定过表达miR-126实验组及对照组结肠癌细胞系HCT116。抽提过表达miR-126实验组及对照组结肠癌细胞总RNA，行RNA质检后进行U6及miR-126的逆转录，然后进行RT-PCR检测过表达实验组及对照组结肠癌细胞系中miR-126的表达，实验重复三次。

(1)逆转录反应:①逆转录体系：RT-Primer 1 μL，Template RNA 4 μg，dNTPs 1 μL，RNase-free water up to 12 μL，65℃ 5 min，立即置于冰上；RNase Inhibitor 1 μL，DTT 2 μL，5×buffer 4 μL，37℃ 2 min，MMLV 1 μL；②逆转录程序：37℃ 50 min， 70℃ 15 min。

(2) RT-PCR:①反应体系：10×miScript Primer 0.4 μL，2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，RNase-free water 7.4 μL，Taq DNA Polymerase 0.2 μL；②realtime PCR程序：95℃ 3 min，95℃12 s，62℃ 50 s，后两步为40个循环。

1.2.2裸鼠皮下成瘤实验(1) 4周龄雄性裸鼠12 只，随机分成两组，培养稳定过表达miR-126细胞株HCT116和对照组细胞株，按照每只裸鼠5×106个细胞，每只裸鼠注射0.2 mL细胞悬液于裸鼠右侧腋下皮下;(2)计算肿瘤体积(V)，V=L×W2×0.52，计算两组皮下移植瘤大小并统计分析。

1.2.3裸鼠尾静脉成瘤实验(1)将12只4周龄雄性裸鼠随机分成两组， miR-126稳定过表达细胞系HCT116实验组及对照组；(2)培养稳定过表达miR-126细胞株HCT116和对照细胞株，按照每只裸鼠1×106个细胞，用1 mL注射器每只注射0.2 mL 细胞悬液于裸鼠尾静脉；(3)注射后密切观察裸鼠的生长情况， 50 d后处死所有裸鼠，取其肺脏、肝脏、脾脏石蜡包埋，再切片行HE染色，若发现转移灶，则计数肿瘤转移灶的数目，并计算肿瘤转移灶的面积，然后对两组裸鼠的数据进行统计分析。

2结果

2.1稳定过表达miR-126结肠癌细胞系HCT116的构建

2.1.1稳定过表达miR-126质粒的构建(1) PCR扩增miR-126前体序列：PCR扩增得到大小为319 bp的产物(图1)。

注：1.PCR产物；2.DNA marker。

(2)过表达载体pGIPZ的线性化：回收miR-126前体，然后用BamH I、Xho I酶对过表达载体pGIPZ行双酶切，酶切后进行电泳，回收大小约11 kb产物(图2)。

(3)菌落的PCR鉴定 阳性克隆可以得到大小为715 bp的条带，阴性克隆则得到434 bp条带(图3)。

(4)阳性克隆的测序：接种阳性转化子后，取100 μL菌液测序，测序结果示过表达载体pGIPZ中插入的目的序列与miR-126的前体序列一致(图4)。

2.1.2慢病毒包装将过表达载体pGIPZ-miR-126(对照组为pGIPZ空质粒)、膜蛋白表达质粒pLTR-G、慢病毒包装质粒pCD/NL-BH共转染293T细胞，于48 h后观察荧光表达，293T细胞中绿色荧光表达明显，证实慢病毒的包装成功。

注：1.DNA marker；2.pGIPZ酶切产物。

注：1.DNA Marker；2~9.挑取的8个转化子；10.空载体；11.H2O。

2.1.3稳定过表达miR-126慢病毒感染HCT116后的荧光表达将过表达miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及pGIPZ空质粒的对照病毒液按MOI=50加入HCT116细胞培基中，培养48～72 h后于荧光显微镜下观察，可见HCT116细胞中有绿色荧光，证明慢病毒感染HCT116细胞成功，下文中用HCT116+pGIPZ-miR-126表示转染了过表达miR-126质粒pGIPZ-miR-126的HCT116细胞，用HCT116+pGIPZ表示转染了pGIPZ对照质粒的HCT116细胞。将流式细胞仪分选后的HCT116+pGIPZ-miR-126、HCT116+pGIPZ扩大培养，荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达(图5)。

注：A、C无荧光，B、D有荧光。

2.1.4Realtime PCR检测miR-126过表达实验组及对照组中的表达Realtime PCR的结果显示：在过表达实验组中miR-126的表达为对照组的5.08倍，差异有统计学意义(P<0.05)，证明稳定过表达miR-126的结肠癌HCT116细胞系构建成功。

2.1.5裸鼠皮下成瘤实验结果图6分别为miR-126过表达实验组及对照组裸鼠，利用公式V=L×W2×0.52计算皮下移植瘤瘤体体积(V)，对两组裸鼠皮下移植瘤的体积进行统计，miR-126过表达实验组(HCT116+pGIPZ-miR-126)裸鼠皮下肿瘤平均体积为(743.81±70.15)mm3，miR-126过表达对照组(HCT116+pGIPZ)裸鼠皮下移植瘤平均体积为(1 413.10±150.16)mm3，对两组数据进行t检验，P<0.05，差异具有统计学意义(图7)。

A.过表达实验组B.过表达对照组

图6HCT116+pGIPZ-miR-126及

HCT116+pGIPZ皮下成瘤组裸鼠

2.1.6裸鼠尾静脉成瘤实验结果将显微镜下观察到的转移肿瘤癌的数目及面积进行统计，结果显示miR-126过表达实验组的平均转移灶的数目为4个，其对照组的平均肿瘤转移灶数目为9个，P<0.05；过表达miR-126实验组肿瘤转移灶的平均面积为(0.26±0.03)mm2，其对照组的肿瘤转移灶平均面积为(0.51±0.04)mm2，P<0.05(图8)。

AB

图8HCT116+pGIPZ-miR-126及HCT116+pGIPZ

尾静脉组裸鼠肺HE染色(40×)

注：A.过表达实验组；B.过表达对照组;实验组与对照组转移灶数目及面积比较，P<0.05。

3讨论

MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度约为19～25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，它通过与靶mRNA的3’端非翻译区完全或不完全互补在转录后的水平调控基因的表达。研究发现，人类miRNA基因有一半以上定位于肿瘤相关基因区域或脆性位点，这个区域时常发生染色体片段的易位、异常扩增、缺失[7]。目前已有大量研究证实miRNA的异常表达与结肠癌的发生发展密切相关，其中包括miR-17、miR-19a、miR-21、miR-34a、miR-143和miR-145等[8-10]。本实验利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-126的结肠癌细胞系HCT116+pGIPZ-miR-126及对照组细胞HCT116+pGIPZ，进行裸鼠皮下、尾静脉成瘤等体内实验，研究miR-126在体内是否能抑制结肠癌细胞的增殖及侵袭转移。

慢病毒(lentivirus)是一种RNA病毒，因其病毒粒子中含有逆转录酶，故又称逆转录病毒。慢病毒颗粒进入宿主细胞后能以自身RNA为模板在逆转录酶的催化下生成互补DNA，然后以此互补DNA为模板来合成双链的DNA，双链DNA经环化后在病毒整合酶的作用下可整合到宿主细胞的染色体上长期地表达[11]。本实验用稳定过表达miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及对照组慢病毒pGIPZ空质粒感染结肠癌HCT116细胞系，感染后通过流式细胞仪筛选纯化被感染细胞(GFP阳性细胞)，纯化后扩大培养并使用RT-PCR技术检测各组细胞中miR-126的表达，结果显示在HCT116 +pGIPZ-miR-126组中miR-126的表达为HCT116+pGIPZ组的5.08倍，P<0.05，差异有统计学意义，证明稳定过表达miR-126的结肠癌HCT116细胞系构建成功。

目前的结肠癌动物模型可分为诱发性、自发性、转基因性及移植性动物肿瘤模型。其中移植瘤模型的成功率高、建立周期较短、生物学性状稳定，能满足肿瘤的生物学研究而被广泛应用。已有大量研究报道miR-126在肺癌、乳腺癌等肿瘤中发挥抑癌的作用。Zhu等[12]研究报道，非小细胞肺癌细胞系A549中过表达miR-126后，可通过抑制VEGFA基因的表达而发挥抑制肺癌细胞的增殖。Yu等[13]实验证实miR-126可抑制卵巢癌细胞的增殖。本研究使用稳定过表达miR-126和其对照组结肠癌细胞HCT116注射于4周龄裸鼠右侧腋下，比较各组皮下移植瘤的体积的大小，结果显示过表达miR-126实验组裸鼠皮下移植瘤体积明显小于其对照组皮下移植瘤体积，P<0.05，差异有统计学意义，说明miR-126具有抑制结肠癌细胞在体内的增殖作用。

另已有多项研究证实miR-126与肿瘤的侵袭转移有关。Sasahira等[14]证实miR-126可通过负调控VEGF基因的表达而抑制口腔癌细胞的迁移、侵袭，发挥着抑癌基因的作用。Frampton等[15]报道miR-126可通过抑制其靶基因ADAM9的表达而抑制胰腺癌细胞的侵袭转移。本研究通过构建稳定过表达miR-126的结肠癌细胞系进行裸鼠尾静脉成瘤实验，结果显示miR-126过表达实验组及对照组裸鼠的肺脏均发现肿瘤转移灶，且统计结果显示miR-126过表达实验组肺脏内的转移灶的数目和面积均低于其对照组(P<0.05)，证实了miR-126可明显抑制结肠癌细胞的侵袭转移。

综上所述，本研究通过动物实验证实了miR-126在体内具有抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移的作用，有可能成为有潜力的结肠癌诊治新靶点。

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Suppression of proliferation and metastasis of colon cancer by miR-126

GUO Ye-qing，ZENG Fan-jun,ZHAO Bi-jun,et al

(YichangCentralHospital&TheFirstClinicalMedicalFacultyof

ThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the function of miR-126 in suppression of proliferation and metastasis of colon cancer in vivo.MethodsWe constructed stable overexpression of miR-126 colon cancer cell line HCT116 with lentiviral vector,and executed subcutaneous tumor formation and tail vein tumor formation test in nude mice with stable overexpression miR-126 colon cancer cell lines.ResultsStable overexpression of miR-126 cell line HCT116 was successfully constructed.Nude mice tumor formation experiment results showed that the mean tumor volume of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than the tumor volume in control group(P<0.05).Tail vein tumor formation experiment results showed that the average number and size of lung metastases of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than those in control group.ConclusionsNude mice tumor formation experiment results confirm that miR-126 can inhibit colon cancer cell＇s proliferation and metastasis in vivo.

Key words:miR-126;colon cancer;lentiviral vector;proliferation;metastasis

(收稿日期：2014-07-15，修回日期：2014-09-25)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.03.009