抗生素微生物检定法中滴加抗生素溶液方法的研究

邰顺章，王晓晶

盐城市药品检验所，盐城 224002

抗生素微生物检定法中滴加抗生素溶液方法的研究

邰顺章，王晓晶

盐城市药品检验所，盐城 224002

目的：探索一种加样方法，用于抗生素微生物检定法中滴加抗生素溶液。方法：根据抗生素微生物检定法实验原理，通过对加样误差来源的分析，比较实验生物统计结果，筛选最佳滴加溶液方法。结果与结论：用微量移液器加样，定量270 μL（以下称本方法），其速度快、间隔时间短、加样量准确、减少实验误差，生物检定统计可靠性测验获得较好的结果，是抗生素微生物检定法实验中较好的加样方法。

微量移液器；加样方法；抗生素微生物检定法；动力学方程；可靠性测验

抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法[1]。是以抗菌活性为指标来衡量抗生素中有效成分含量的一种方法，与临床治疗疾病的要求一致，因而更能反映抗生素的医疗价值。该方法具有灵敏度高、可靠性好、适用性广、便于掌握等特点。所以抗生素微生物检定法自20世纪40年代建立以来，一直收载于各国药典中，成为抗生素含量测定的国际通用的经典方法。但该方法操作步骤多，影响因素多，耐用性差，实验过程会带来众多操作误差，新手难以掌握，测定结果的可靠性检验常常难以得到满意的结果，需要从实验的各个环节加以严格控制[2-6]。随着色谱法和光谱法在抗生素含量测定中的应用，抗生素含量测定方法得到了拓展，但对由生物发酵制得的多组分抗生素，因其组分比较复杂，生物活性成分的比例不稳定，各组分的抗菌效力不同等因素，无法由理化方法替代，故抗生素微生物检定法至今仍然是抗生素含量测定的重要方法之一。本文对抗生素微生物检定法之管碟法的供试液滴加方法进行了探讨，提出采用微量移液器定量（270 μL）加样，对供试液滴加方法进行更具体的规定，可提高该实验的准确度，减少实验误差。

1 管碟法的基本原理

管碟法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法[7]。即将含试验菌的琼脂培养基均匀浇注在碟底，不锈钢小管置于其上，向小管内滴加抗生素溶液，抗生素溶液向培养基内呈球形扩散。在琼脂培养基内抗生素浓度高于最低抑菌浓度，细菌生长就受到抑制，从而形成透明的抑菌圈，圈的边缘处浓度恰好为抗生素最低抑菌浓度。通过测量抑菌圈的面积或直径，经计算得到可靠性检验结果和抗生素含量。抑菌圈的形成遵循以下动力学方程[8]。

r-抑菌圈的半径，mm；D-扩散系数，mm2/h；t-扩散时间，细菌刚生长到显示抑菌圈时间，h；M-抗生素在小钢管中的量，U或μg；H-培养基的厚度，mm；C′-最低抑菌浓度，U/mm3。

从动力学方程可以看出，抑菌圈的大小受扩散系数、扩散时间、抗生素的总量、培养基的厚度及最低抑菌浓度因素的影响，抗生素在小钢管中的量的对数值与抑菌圈半径的平方值成直线关系，从抑菌圈半径来推算出抗生素的量是抗生素微生物检定法的理论基础。应用生物检定平行线设计原理，在相同试验条件下将标准品和供试品溶液进行比较，可以抵消培养基的厚度（H）和最低抑菌浓度（C′）的影响；用相同的缓冲液稀释标准品和供试品溶液，可减小标准品溶液和供试品溶液在同一培养基中扩散系数（D）的差异；扩散时间（t）和抗生素在小钢管中的量（M）与滴加供试液密切相关，是抗生素微生物检定法操作过程中的最关键步骤之一。

2 药典对在小钢管中滴加抗生素量的控制

抑菌圈半径的平方值与抗生素在小钢管中的量的对数值呈直线关系，抗生素标准品和供试品溶液加入量的准确性直接影响实验结果的准确度，《中国药典》对在小钢管中滴加抗生素量的控制方法也作了一定的规定。

2.1 加样量的分析

国外药典和《中国药典》及其以往版本都采用控制不锈钢小管的容积来控制加样量。通过规定不锈钢小管高度、内径误差范围，来控制不锈钢小管的容积误差，从而控制加样量的准确性。

现行《中国药典》2010年版规定，不锈钢小管的内径为（6.0±0.1）mm，高为（10.0±0.1）mm，外径为（7.8±0.1）mm。根据这一规定可以对不锈钢小管的容积进行允许误差分析，见表1。

表1 不锈钢小管容积的允许误差

由表1可以看出，以装满小钢管为度来确定抗生素溶液的加入量，因不锈钢小管容积的允许误差偏大，精密度远远超出了分析要求。

对滴加供试液的方法各国药典都没有规定具体的要求，《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ A“抗生素微生物检定法”规定：在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高、低两种浓度的供试品溶液[1]。《中国药品检验标准操作规范》要求：滴加溶液至钢管口平满。传统的采用目视各小钢管液面是否一致来决定加样量，因没有统一的刻度参照、实验者视力的差别、各不锈钢小管位置不同造成的角度上的差别等，对加样量都会产生一定的误差。

2.2 加样时间的分析

在滴加供试液过程中，因各管分别滴加，顺序有先后，加样时间不一致，由于溶液在加入不锈钢小管后即开始向培养基中渗透，先加者先渗透，对扩散时间（t）会产生一定的误差，所以滴加溶液的间隔时间不可过长，以免影响测定结果。《中国药品检验标准操作规范》规定：滴加溶液的顺序为SH→TH→TL→SL，以消除加样操作的系统误差。连续滴加双碟数目不超过5个，如果1份溶液滴加双碟数目过多，可分组滴加，以缩短滴加溶液的间隔时间[7]。

3 3种加样方法比较

3.1 实验仪器及试剂

玻璃滴管（自制）；1 mL卡介苗注射器；微量移液器；钢管放置器；十万分之一电子天平（Sartorius BP211D）；压力蒸汽灭菌器（上海，博迅）；ZY-300Ⅳ型多功能微生物自动测量分析仪（北京，先驱）；恒温水浴箱；隔水式培养箱（上海，博迅）；冰箱（青岛，海尔）；不锈钢小管；效价测定专用双碟以及常用玻璃仪器。培养基和磷酸盐缓冲液等。

3.2 统计分析

本所从2005年4月以来，使用“3.1”所列仪器一直未更换，固定人员做抗生素微生物检定法实验，曾在不同阶段用自制玻璃滴管、1 mL卡介苗注射器、微量移液器作为抗生素微生物检定法加样工具，经提取468份检验记录统计分析，以回归、偏离平行两项的F值以及可信限率3项进行可靠性检验，其结果存在明显的相关性差异。结果见表2。

表2 3种方法加样效果比较

从表2可以看出，采用微量移液器定量加样，对于扩散时间（t）和抗生素在小钢管中的量（M）的控制明显优于玻璃滴管液面目测法和用卡介苗注射器定量加样法，生物统计中的回归和可信限率具有明显的相关性。

4 讨 论

4.1 抗生素微生物检定法实验加样方法由用不锈钢小管容积定量改为用微量移液器定量加样。本文建议定量体积为270 μL，加样量均低于小钢管的上沿，使每个不锈钢小管内溶液的张力一致，又不易溅到不锈钢小管外，可提高加样速度，缩短间隔时间，且移动平皿时不易溢出。

4.2 用微量移液器定量加样。由于各管所加体积是一定的，可以消除先加先渗透到琼脂层带来的体积误差，实验过程中不需要考虑在滴加过程中各管已渗透进入培养基中的抗生素溶液体积和抗生素溶液在小管中的液面位置，这对加样操作带来了很大的便捷，大大地减少了抗生素在小钢管中的量（M）的误差和扩散时间（t）的误差。

4.3 本方法选用48个不锈钢小管进行标号，并称重和测量内外径，用此法加液在其中滴加同一抗生素溶液进行试验，表明所用的不锈钢小管的内外径大小和重量对抑菌圈的扩散有一定的影响，但很微小。本方法使用的为同一包装中的不锈钢小管，可能也会带来一定的误差。

4.4 通过对不同的加样方法进行比较，本方法的加样时间明显缩短，减少至前两种方法的一半以下；经对468份检验报告可靠性测验结果的统计分析，回归和可信限率都有较大幅度的提高；偏离平行略有提高，但变化不很明显。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 （二部）[S].北京：化学工业出版社，2010，附录93-8.

[2]丁 勃，杨 娜，谢元超.比浊法测定抗生素效价中常见问题及分析[J].中国药品标准，2010，11（6）：438-40.

[3]杨亚莉，胡昌勤.《中国药典》2005年版微生物检定法的增修订情况及要点 [J].中国抗生素杂志，2005，30（12）：721-6.

[4]贺 微，高 晔.正交法探讨抗生素微生物检定法的影响因素[J].实用医药杂志，2004，21（4）：354-5.

[5]袁雯玮.各国药典抗生素微生物检定法的比较和评价[J].中国药品标准，2000，1（1）：19-20.

[6]胡功允，张琪霞.《中国药典》抗生素微生物检定上层培养基中加菌量的研究 [J].药物分析杂志，1997，17（5）：332-4.

[7]姚尚辰.抗生素微生物检定法[S].中国药品检验标准操作规范，2010，286-95.

[8]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社，2000，73.

Method of Dropwise Adding Antibiotics Solution in Microbiological Assay of Antibiotics

TAI Shun-zhang,WANG Xiao-jing
Yanchen Institute for Drug Control,Yancheng 224002

Objective:To explore a sampling method that is used for antibiotics solution dropping in microbiological assay of antibiotics.Methods:Microbiological assays of antibiotics were compared for their differences of experimental principles,source about sampling error and results of experiments to choose the best methods of dropwise adding antibiotics solution.Results and Conclusion:Micropipettor sampling, quantitative 270 μL,was proved to have fast speed,short interval time,precise sample volume,reduced experimental error and better results in reliability bioassay test,which showed to be the better sampling method in the experiment.

Micropipettor;Methods of sample;Microbiological assay of antibiotics;Kinetic equation;Re-liability test

R915

A

1673-7806（2015）03-271-03

邰顺章，男，副主任药师 E-mail:417677528@qq.com

2014-11-15

2015-01-08