LC-MS/MS测定人血清帕拉德福韦浓度方法的建立及在人体药代动力学研究中的应用

张 烨，肖青青，申 璐，杨 劲*

中国药科大学1药物代谢动力学研究中心；2临床药学教研室，南京 210009

LC-MS/MS测定人血清帕拉德福韦浓度方法的建立及在人体药代动力学研究中的应用

张 烨1，肖青青2，申 璐1，杨 劲1*

中国药科大学1药物代谢动力学研究中心；2临床药学教研室，南京 210009

目的：建立人血清帕拉德福韦浓度检测方法并运用于人体药代动力学研究。方法：血清样品乙腈沉淀蛋白处理后，采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定。以0.2 mmol·L-1乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm×2.1 mm，5 μm）分离，梯度洗脱。帕拉德福韦及内标 （恩替卡韦）监测离子对为m/z 424.1→151.0；m/z 278.3→152.1。运用建立的方法测定健康受试者血清中药物浓度。结果：帕拉德福韦血清药物浓度在0.5~500 ng·mL-1的范围内线性关系良好，方法回收率、日内及日间精密度均符合方法学要求。结论：该方法专属性强、灵敏度高，可用于帕拉德福韦人体药动学研究。

帕拉德福韦；LC-MS/MS；药代动力学

具有自主知识产权的抗乙肝病毒Ⅰ类新药甲磺酸帕拉德福韦——[9-[2-[2，4-顺式-（S）-（+）-4-（3-氯苯基）-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环己烷-2-基]甲氧基乙基]腺嘌呤]，是口服的阿德福韦（PMEA）前药，具有一定肝脏靶向性。它采用HepDirectTM专利技术开发，肝靶向能力源于母体药物PMEA的碳磷酸盐化合物的化学改性，最终形成环状碳磷酸盐化合物二酯衍生物。碳磷酸盐化合物二酯在中性或酸性pH值下对水解作用稳定。其结构中的4-芳基取代基能被肝脏细胞色素P450同工酶3A4（CYP3A4）特异识别并催化氧化，从而释放PMEA。后者能与脱氧腺苷三磷酸竞争或直接整合到病毒DNA中，从而抑制乙肝病毒的DNA多聚酶，引起DNA链延长终止，发挥抗乙肝病毒作用[1]。

目前该药已进入临床研究阶段，而文献报道的样品处理方法为固相萃取法[2]，耗时较长、步骤繁琐。本文拟建立简单高效的LC-MS/MS的帕拉德福韦血药浓度检测方法，并运用该方法测定健康受试者帕拉德福韦血清浓度。

1 材 料

1.1 药品与试剂

甲磺酸帕拉德福韦（西安新通药物研究有限公司，批号D120301，纯度99.54%）；恩替卡韦（内标，海南中和药业有限公司，批号20081001，纯度100.2%）。

乙腈为色谱纯（Merk公司）；乙酸铵（西陇化工股份有限公司，批号130916；纯度≥98%）；超纯水。

1.2 仪器

Sartorius BT25S电子天平 （赛多利斯仪器系统有限公司）；H-101型多功能漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）；芬兰单道移液器（Thermo Electron公司，美国）；Sigma 3K15高速冷冻离心机 （Sigma公司，德国）；API3000液相串联质谱联用仪，含：自动进样器、在线脱气系统、柱温箱、二元梯度泵、电喷雾离子化接口、三重四极杆质谱检测器、色谱工作站（Analyst 1.4.2）、Analyst 1.4.2定量处理软件（Ap-plied Biosystems公司，美国）。

2 实验方法

2.1 标准溶液配制

2.1.1 帕拉德福韦对照品溶液 精密称取甲磺酸帕拉德福韦12.3 mg（经物质的量和纯度换算，相当于含帕拉德福韦10.0 mg）于10 mL棕色量瓶中，超纯水溶解并稀释至刻度，即得1 mg·mL-1的储备液，置于-20℃冰箱保存备用。储备液逐级用超纯水∶甲醇 （1∶1，v/v）稀释，配制为含帕拉德福韦为5、2、1μg·mL-1，500、200、100、50、20、10、5 ng·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 恩替卡韦对照品溶液 精密称取恩替卡韦10．0 mg于10 mL量瓶中，加入甲醇∶水（1:1，v∶v）溶解并稀释至刻度，即得1 mg·mL-1恩替卡韦储备液；取储备液适量加入超纯水∶甲醇（1∶1，v/v）稀释，配成1 μg·mL-1的标准溶液，于4℃冰箱中保存待用。

2.2 色谱、质谱条件

Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm× 2．1 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：0．2 mmol·L-1乙酸铵水溶液 （A）-乙腈 （B）（梯度洗脱程序：0～1．0 min，10%B；1．0～2．0 min，由10%B变至85%B；2．0～3．5 min，85%B；3．5～6．5 min，由85%B变至10%B）；流速：0．3 mL·min-1；自动进样器温度4℃；进样量：5 μL。

电喷雾电离源（ESI源），扫描方式为多重反应监测（MRM），正离子模式；源喷射电压（IS）：5500 V；碰撞气压（CAD）：27．58 kPa；门帘气压（CUR）：68．95 kPa；雾化气压（NEB）：82．74 kPa；离子碎片检测信号：帕拉德福韦m/z 424．1→151．0；内标（恩替卡韦）m/z 278．3→152．1。帕拉德福韦质谱参数为DP：47 V；EP：10 V；CE：36 V；CXP：10 V。恩替卡韦（内标）质谱参数为DP：40 V；EP：10 V；CE：27 V；CXP：10 V。1．1 min切入质谱，3．4 min切出质谱，共采集2．3 min。质谱分析图见图1。

图1 质谱特征离子图

2.3 血清样品前处理方法

于1．5 mL EP管中精密加入血清样品100 μL，加入300 μL含内标的乙腈 （内标浓度30 ng·mL-1）沉淀蛋白，涡旋2 min，12000 r·min-1离心6 min，取上清液100 μL转入进样小瓶，进行LC-MS/MS分析，进样量5 μL。

3 方法学验证及结果

3.1 专属性考察

取6份不同来源空白人血清，考察检测方法的特异性，结果表明，本实验LC-MS/MS条件下，帕拉德福韦出峰时间在2．83 min左右；内标(恩替卡韦)出峰时间在1．43 min左右；峰形良好，在出峰位置无杂峰干扰测定，基线平稳。空白血清、空白血清+待测物+内标的血清样品色谱图见图2。

图2 典型色谱图

3.2 标准曲线及定量下限

取1．5 mL EP管数支，分别加入不同浓度的帕拉德福韦标准品溶液后，40℃下氮气挥干，加入空白血清100 μL，旋涡混匀，配制成含有帕拉德福韦0．5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的标准系列样品，按“2．3”项下方法操作后进样，记录色谱图，以待测物的浓度为横坐标，待测物的峰面积与内标物的峰面积比值为纵坐标，进行权重回归计算，得到回归方程：f=0．0554c+0．00413，r=0．9996，权重系数w=1/c。结果表明，药物浓度在0．5～500 ng· mL-1范围内，线性关系良好。

定量下限（LLOQ）为0．5 ng·mL-1，信噪比大于10，连续测定6份LLOQ样品准确度为94．23%，RSD为5．82%。

3.3 精密度及准确度

制备帕拉德福韦浓度分别为1、8、80、400 ng· mL-1的质量控制（QC）样品，每个浓度进行5样本分析，连续测定3天，按“2．3”项下方法操作，将待测物浓度和待测物的峰面积与内标物的峰面积比值代入当日的随行标准曲线，计算QC样品的测得浓度，并以QC样品结果计算准确度与精密度，结果见表1。本法的准确度与精密度符合生物样品分析要求。

3.4 稳定性考察

制备帕拉德福韦浓度分别为1、8、80、400 ng· mL-1的质量控制（QC）样品，每一浓度平行配制3份，共配制4批。1批按“2．3”项下方法操作，立即处理并进行LC-MS/MS分析，记录色谱图；将即刻稳定性的样品在测定完成后，于进样架中放置24 h后再次进样分析，记录色谱图；1批于室温下冰浴放置4 h后，按“2．3”项下方法操作并立即进行LC-MS/ MS分析，记录色谱图；1批在-80℃冰箱反复冻融3次后按“2．3”项下方法操作并立即进行LC-MS/MS分析，记录色谱图；1批于-80℃冰箱放置94 d后，按“2．3”项下方法操作并立即进行LC-MS/MS分析，记录色谱图；分别计算帕拉德福韦峰面积As、内标峰面积Ai的比值f（f=As/Ai），将该比值代入当批随行标准曲线方程，计算实测浓度和百分偏差，结果见表2。结果表明，帕拉德福韦血清样品即刻、反复冻融3次、在进样架放置24 h、室温下冰浴放置4 h以及-80℃冷冻94 d的条件下稳定性良好。

表1 LC-MS/MS法测定帕拉德福韦的精密度、准确度、提取回收率及基质效应结果

表2 帕拉德福韦血清样品稳定性考察结果（n=3）

3.5 提取回收率

本实验考察了帕拉德福韦4个浓度，即1、8、80、400 ng·mL-1下的提取回收率。以经过提取所得的待测物色谱峰面积与未经提取直接进样所得的待测物色谱图峰面积之比，来考察样品的提取回收率，每浓度进行5样本分析，结果见表1。帕拉德福韦在以上4个浓度的提取回收率分别为 （115．18± 14．81）%、（98．66±8．82）% 、（107．34±6．81）% 及（108．10±6．98）%，不同浓度水平的帕拉德福韦提取回收率RSD＜15%，表明该方法提取回收率较稳定。

3.6 基质效应

考察不可见成分干扰对待测药物帕拉德福韦离子化效率的影响情况。取不同志愿者空白血清，按“2．3”项下方法操作后加入不同浓度帕拉德福韦标准溶液及内标，进行LC-MS/MS分析获得峰面积，与相同浓度混合标准品溶液及内标溶液直接进样获得峰面积比较，评价基质效应，结果见表1。不同浓度帕拉德福韦基质效应为74．83%～80．70%，6批基质计算的内标归一化的基质因子的RSD＜10．88%。血清中的共流出成分对帕拉德福韦的离子化效率产生一定抑制作用，不同浓度水平抑制效率在同一水平上。

3.7 残留效应

以定量上限 （ULOQ）500 ng·mL-1进行LC-MS/ MS分析后随即进样空白血清提取物，重复3次考察方法的残留效应，结果表明，在ULOQ进样后再进空白血清提取物，在待测物出峰位置无响应，表明该方法残留效应符合要求。

4 建立的方法在人体药动学研究中应用

本实验建立的方法成功地运用于甲磺酸帕拉德福韦临床剂量爬坡试验（10～120 mg）的血清药物浓度的测定。一切按规范要求处理。根据入选标准选择健康受试者，男女各半，试验前签署知情同意书。受试者空腹过夜后次日早上7点温开水送服10、30、60、90 mg或120 mg甲磺酸帕拉德福韦片，并在服药后继续空腹4 h。早中晚餐统一进食。给药后 0 h、15、30、45 min，1、1．5、2、3、4、6、8、12、16、24、36、48、72、96、120 h采集血清样品。运用本实验建立的方法测定血清药物浓度，最低剂量组（10 mg）和最高剂量组（120 mg）平均药-时曲线见图3。

5 讨 论

本实验采取蛋白沉淀的样品前处理方法，与已有文献报道的检测方法相比[2]，操作简单、快捷。通过实验发现，与甲醇相比，乙腈能更好地使待测物与蛋白质等内源性物质分离，并且3倍体积的沉淀剂可起到稀释基质作用，进一步降低基质效应对待测物响应的影响。但是，直接蛋白沉淀对生物样品中强极性基质去除效果不佳。因此，需要在色谱洗脱时将待测物与生物样品中的强极性基质分离。Thermo BDS HYPERSIL C18column（150 mm×2．1 mm，5 μm）对强极性基质保留较弱，通过调节优化流动相洗脱梯度，延后待测物出峰时间，使待测物与内源性组分在色谱柱中差速分离，以此避免基质效应引起的响应抑制和响应波动[3]。另外，利用阀切换功能，将先从色谱柱中流出的内源性基质切出质谱，从而避免了大量基质聚集于电喷雾口与待测物在雾滴表面离子化的过程中产生竞争导致待测物离子化效率降低[4]。

图3 健康受试者单剂量口服10 mg或120 mg甲磺酸帕拉德福韦后药时曲线（n=6）

为了满足甲磺酸帕拉德福韦临床剂量爬坡试验的需求，本实验所建立的标准曲线方程线性范围为0．5～500 ng·mL-1。由于线性范围较宽，为避免残留效应的产生，采取了增加洗针次数为4次，即进样前洗针2次，进样后洗针2次。经方法验证，增加洗针次数能有效消除残留效应。

[1]Erion MD,Reddy KR,Boyer SH,et al．Design,syn-thesis,and characterization of a series of cytochrome P (450)3A-activated prodrugs(HepDirect prodrugs)useful for targeting phosph(on)ate-based drugs to the liver[J]．J Am Chem Soc,2004,126(16):5154-63．

[2]Lin CC,Xu C,Teng A,et al．Pharmacokinetics of pradefovir and PMEA in healthy volunteers after oral dosing of pradefovir[J]．J Clin Pharmacol,2005,45(11): 1250-8．

[3]Bennett PK,Horne KV．Identification of the major en-dogenous and persistent compounds in plasma,serum, and tissue that cause matrix effects with electrospray LC/MS techniques[C]．AAPS Conference,Salt Lake City, Utah,2003．

[4]Bonfiglio R,King RC,Olah TV,et al．The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug com-pounds[J]．Rapid Commun Mass Spectrom,1999,13 (12):1175-85．

Establishment of an LC-MS/MS Method for the Determination of Pradefovir in Human Serum and the Application in Clinical Pharmacokinetics

ZHANG Ye1,XIAO Qing-qing2,SHEN Lu1,YANG Jing1*
1Center of Drug Metabolism and Pharmacokinetics;2Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective:To set up a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric(LC/MS/MS) method for the determination of pradefovir in human serum and to apply it to the clinical pharmacokinet-ics．Methods:The serum sample was precipitated by acetonitrile，and the supernatant was analyzed by LC-MS/MS．Chromatographic separation was performed on a Thermo BDS HYPERSIL C18column(150 mm× 2．1 mm,5μm)with a gradient elution system of 0．2 mmol·L-1ammonium acetate buffer-acetonitrile at a flow-rate of 0．3 mL·min-1．The ion transitions recorded in multiple reaction monitoring mode were m/z 424．1([M+H]+)→151．0 for pradefovir and m/z 278．3([M+H]+)→152．1 for the internal standard．The estab-lished method was used to determine the serum concentration of pradefovir in healthy subjects．Results:The linear range of calibration curves for pradefovir was 0．5-500 ng·mL-1．The recovery and the intra-and inter-assay precisions met the requirements of bioanalytical methods．Conclusions:The method is proven to be rapid,specific and sensitive．It can be used for the clinical pharmacokinetic study．

Pradefovir;LC-MS/MS;Pharmacokinetics

R969.1

A

1673-7806（2015）03-263-04

张烨，女，研究生 E-mail:yeah19880927@sina.com

*通讯作者杨劲，男，副教授，硕士生导师 E-mail:yjcpu@yahoo.com

2015-03-28

2015-05-12