红芸豆植物凝集素终止小鼠中晚期妊娠对胎盘组织的影响研究

杨成焕 杨 姚 李 阔 王静静 姚娅婷 张 田 王敏康

云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心（昆明，650500）

以往的研究发现芸豆植物凝集素（PHA）可抑制受精、抗着床［1－2］、影响胚胎发育并具有终止妊娠作用［3－4］。同时还具有明显的抗人免疫缺陷病毒作用［5－6］。随着对其各方面的深入研究，越来越多的证据显示其在生物、医学、畜牧业中具有广泛的应用价值。相关研究表明在终止妊娠方面，红芸豆PHA是通过直接与子宫和胎盘接触而发挥作用，但其终止妊娠作用是以何种途径实现尚不清楚。胎盘是连接母体与胎儿的重要器官，对妊娠的维持具有重要作用。本实验通过对红芸豆PHA导致流产的小鼠胎盘进行显微形态学观察、DNA提取与电泳以及胎盘与子宫8－异前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）的检测，以了解红芸豆PHA在终止小鼠妊娠时对胎盘的形态和功能的影响，为研究红芸豆PHA终止妊娠机制提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

红芸豆PHA，由本实验室从红芸豆（Phaseolus vulgaris Linnaeus）中提取并进行浓缩。用于注射的PHA含0.8%氯化钠，使用前用PBS配制成所需的浓度。注射用血清促性腺激素（PMSG），杭州动物药品厂，生产批号：140102；注射用人绒毛膜促性腺激素（hCG），杭州动物药品厂，生产批号：140214；动物组织基因组（DNA）提取试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司生产，货号：CW0546；小鼠8－异前列腺素 F2α（8－iso－PGF2α）ELISA 试剂盒、甲基绿、派诺宁Y均购于上海源叶生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（TUNELPOD），上海七海复泰生物科技有限公司，货号：AP005－3；DAB显色试剂盒，北京索莱宝科技公司，货号：DA1010；其余试剂均为国产分析纯试剂。TGL－168高速台式离心机，上海安亭科学仪器。

1.2 实验动物

健康昆明白小鼠，体重25～28g，购于昆明医科大学实验动物中心。室温21～25℃饲养，12h光照，12h黑暗，自由摄食与饮水。

1.3 实验方法

1.3.1 动物处理及取材 对性成熟雌鼠进行超排卵处理：下午6：00皮下注射PMSG，剂量为5U／只，48h后腹腔注射hCG，剂量为5U／只。然后与雄鼠按2∶1合笼，次日见栓者为妊娠第1天。于妊娠第14天给药，分为PHA和PBS两组，每组40只。再按不同时间处理段分为4个小组，每小组10只。给药方式为非手术法经阴道单侧子宫单次注射。PHA组注射红芸豆PHA 5mg／只。PBS组注射PBS，0.05ml／只。分别于注射后2h、5h、8h和24h或看到流产现象时对小鼠进行断颈处死，分离子宫并除去胎鼠，取子宫段和胎盘分别匀浆，3000g离心10min，取上清用于测定8－iso－PGF2α，一部分子宫和胎盘保存于－20℃冰箱，用于DNA提取，剩余部分用中性甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.3.2 子宫、胎盘染色及DNA提取 ①子宫台盼蓝染色：分别于注射后2h、5h、8h和24h或看到流产现象时对小鼠进行断颈处死，经子宫角注射0.5%台盼蓝，使子宫充满，10min后分离子宫并用PBS洗去多余台盼蓝，去除胎儿，保留子宫和胎盘部分观察。②孕鼠子宫及胎盘核酸电泳：取－20℃保存的孕鼠子宫及胎盘按动物组织基因组（DNA）提取试剂盒说明书提取DNA，1%琼脂糖凝胶电泳［7］。③子宫及胎盘甲基绿－派诺宁染色：取固定的孕鼠子宫和胎盘于48h内进行石蜡包埋和切片、甲基绿－派诺宁染色（5%派诺宁、2%甲基绿）、脱水、封片并显微镜观察。④ 胎盘的TUNEL检测：取固定的子宫与胎盘于48h内进行石蜡包埋和切片、并按试剂盒说明书进行TUNEL显色和镜检。

1.3.3 子宫及胎盘8－iso－PGF2α测定 匀浆离心后的上清液按小鼠8－iso－PGF2αElisa试剂盒的使用说明进行洗板、孵育等操作。用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，根据标准品读数作出标准曲线方程，并根据标准曲线方程计算出孕鼠各个时间段的8－iso－PGF2α值。用统计软件 SPSS11.5分别对孕鼠子宫和胎盘匀浆的8－iso－PGF2α进行独立样本t检验（Independent Samphes Test）分析。

2 结果

2.1 妊娠结局

PBS组孕鼠无明显异常行为表现，而PHA组孕鼠则出现腹部收缩以及轻微毛发蓬松现象，在注射红芸豆PHA 7.5～9.5h后孕鼠出现流产现象。解剖观察表明，PBS组孕鼠子宫及胚胎均正常，而注射红芸豆PHA组孕鼠子宫系膜和胎盘充血明显（图1）；注射红芸豆PHA后8h及出现流产现象时，还伴有胎鼠与胎盘脱落或易与胎盘分离、胎盘与PBS组胎盘相比明显变薄且易与子宫分离。

图1 小鼠胎盘充血情况直观图

2.2 染色结果

台盼蓝染色后肉眼观察可见PHA组胎盘颜色较PBS组深，且子宫一侧靠近边缘处出现一圈深色染色区域（图2），解剖镜下可见此处颜色加深呈蓝色。解剖镜下亦可见PBS组与PHA组胎盘边缘、子宫以及羊膜均有台盼蓝染色。但PHA组胎盘在近子宫一侧的边缘附近一圈染色是PBS组所没有的。甲基绿－派诺宁染色（图3）则显示出：与PBS组相比，PHA组切片颜色红色较多，绿色较少，且随着时间推移，对比越明显。图3D、3F、3H较3A、3B、3C、3E、3G 颜色偏紫红，说明注射PHA 后5h、8h及孕鼠出现流产现象时细胞凋亡较明显。

图2 小鼠胎盘台盼蓝染色直观图（200×）

图3 甲基绿－派诺宁染色效果图（400×）

2.3 TUNEL检测结果

固定后的胎盘经DAB显色后镜检可看到细胞存在凋亡现象（DAB显色后呈棕色）。注射PHA 5h后胎盘细胞的凋亡现象明显高于PBS组（图4、图5），且在5h时细胞凋亡主要存在于胎盘近子宫侧。

2.4 电泳结果

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示PBS组和PHA组胎盘DNA存在差异：PBS组电泳条带单一，只有唯一一条条带，而且条带相对整齐，而PHA组条带存在明显的拖尾现象（图6A）。子宫DNA电泳两组无明显差异，均出现单一的条带（图6B）。

图4 TUNEL检测结果图（40×）

图5 TUNEL染色检测结果比较（400×）

图6 子宫和胎盘的DNA电泳图

2.5 8－iso－PGF2α检测结果

注射红芸豆PHA后2、5、8h及流产时，PHA组孕鼠胎盘匀浆中8－iso－PGF2α的水平和PBS组比较无差异（表1），而孕鼠子宫匀浆中8－iso－PGF2α水平在注射红芸豆PHA后2h、8h及流产时明显低于注射PBS组（表1）。从图7可以看出PBS组胎盘内和子宫内8－iso－PGF2α水平的变化趋势是一致的，但PHA组胎盘内和子宫内8－iso－PGF2α水平的变化趋势并不一致，子宫内8－iso－PGF2α在注射PHA后到孕鼠出现流产时呈下降趋势。

表1 胎盘和子宫8－iso－PGF2α含量随时间变化情况（pg／ml）

图7 胎盘和子宫中8－iso－PGF2α水平浓度变化情况折线图

3 讨论

胎盘承担着母体与胎儿间营养物质与代谢物质交换的重任，同时胎盘还分泌许多与妊娠相关的激素，所以，胎盘功能的保持对维持妊娠是至关重要的。本实验结果表明，在注射红芸豆PHA后孕鼠胎盘表观出现淤血现象，胎盘部分的台盼蓝着色也表明PHA处理组导致胎盘组织出现细胞死亡。与甲基绿—派诺宁染色以及TUNEL检测、电泳结果进行关联比较均说明小鼠胎盘在注射红芸豆PHA后出现明显的细胞凋亡和组织坏死。进而，红芸豆PHA产生的凝血作用也应该是造成胎盘丧失维持妊娠作用的一个重要原因。妊娠中期胎盘产生大量的孕酮［8］，胎盘受损必然导致其功能受影响，例如直接影响胎盘孕酮的合成和损害胎盘血液循环。这些都是导致妊娠终止的原因。

本实验中注射PHA后子宫匀浆8－iso－PGF2α水平明显下降，与引产［9］和自然分娩［10］的子宫中，PGF2α显著升高的结论不太一致，其原因可能有两点。其一，文献［9－10］中测定的是子宫腔内液的PGF2α水平，而本实验检测的是子宫组织匀浆中的PGF2α水平。在分离子宫和胎盘后，均用纱布擦干表面液体，然后再匀浆处理，因此子宫匀浆PGF2α水平偏低很可能是因为原先合成的PGF2α已大量释放。其二，PGF2α的作用程序与子宫状态和激素水平有关。子宫肌细胞上PG受体随妊娠进展而增加，分娩期达高峰，中晚期妊娠子宫对PG更为敏感［11－12］。PHA 组子宫匀浆 8－iso－PGF2α水平明显下降可能与胎盘的变化有关联，虽然检测结果中注射PHA后胎盘匀浆8－iso－PGF2α水平升高无统计学意义，但是PHA组每个受测个体8－iso－PGF2α水平均高于PBS组。

与天花粉蛋白［13］一样，红芸豆PHA在终止妊娠时，对作用部位有一定的细胞专一性。综合以上及相关实验结果，我们认为红芸豆PHA终止妊娠的机制在对胎盘的专一性结合和作用方面与天花粉蛋白是类似的，即红芸豆PHA与胎盘滋养层细胞结合后，通过损伤引起细胞凋亡和副凋亡途径，从而破坏滋养层细胞（特别是合体滋养层细胞）。通过产生坏死和凝血等综合作用，进而达到终止妊娠的作用。但也有所区别，比如其显著的凝血作用。而且红芸豆PHA几乎没有任何天花粉表现出的毒副作用［14－15］。

通过广泛深入的研究和验证，红芸豆PHA有可能发展成为一种高效，具有特异性和作用范围更广的新型终止妊娠药物。

［1］ 陈蕙玲，周念辉，孙册.ConA的抗着床效应［J］.生理学报，1988，40（2）：202～207.

［2］ 张丽芬.芸豆植物凝集素（PHA）对小鼠体外受精及胚胎发育的影响［D］.昆明：云南师范大学硕士学位研究生毕业论文，2010.

［3］ 张丽芬，王昌梅，杨明洁，等 ，芸豆植物凝集素对小鼠体外受精的影响［J］.中国计划生育学杂志，2011，19（2）：81～85.

［4］ 张丽芬，王昌梅，杨明洁，等，芸豆植物凝集素终止小鼠中晚期妊娠的研究／／中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集［C］.北京：中国生理学会，2010：4.

［5］ Oppenheimer SB，Alvarez M，Nnoli J.Carbohydrate－based experimental therapeutics for cancer，HIV／AIDS and other diseases［J］.Acta Histochem，2008，110（1）：6～13.

［6］ Sindhura BR，Vishwanath Reddy H，Inamdar SR，et al.Lectins：Magic Bullet towards HIV Gp120［J］.Antivir Antiretrovir，2012，4：101～102.

［7］ 高超，华子春.细胞凋亡检测方法新进展［J］.中国细胞生物学学报，2011，33（5）：564～569.

［8］ 王淑贞，袁耀萼.妇产科理论与实践［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：874.

［9］ Ciba Foundation Symposium 47（News Series）.The Fetus and Birth［M］.Elsevier Excerpta Medica North Holland Amsterdam Oxford：New York，1997，343.

［10］ Fuchs AR，Husslein P，Fuchs F.oxytocin and the initiation of human parturition.II.Stimulation of prostaglandin production in human decidua by Oxytocin［J］.Am J Obstet Gynecol，1981，141（6）：694－697.

［11］ 石彬，王振海.前列腺素类药物终止中期妊娠研究现状［J］.国外医学计划生育分册，2008，19（3）：150～152.

［12］ 贾瑞喆，刘晓梅.妊娠晚期子宫平滑肌与蜕膜组织中前列腺素E2与F2alpha的表达与缩宫素引产的关系［J］.江苏医药，2009，25（5）：501～503.

［13］ 熊用周，潘平，徐绍嫣，等.天花粉蛋白对体外培养人胎盘绒毛滋养层细胞影响的研究［J］.动物学报，1976，22（2）：172～179.

［14］ 张茹，黄利鸣，岑畅飞.天花粉蛋白作用机制研究进展［J］.时珍国医国药，2009，20（12）：3116～3117.

［15］ 仇伟欣.天花粉药理学研究进展［J］.中国中医药信息杂志，1996，3（6）：11～13.