HPS OmpP2膜外结构环诱导PAMs IL- 8 mRNA转录的研究

罗银珠，贺现辉，周素明，冯赛祥，姚文凤，徐成刚，廖　明，辛朝安（.华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点开放实验室，广东广州5064；.宁波大学海洋科学院海洋生物应用重点实验室，浙江宁波5；.广东省河源市动物疫病预防控制中心，广东河源57000）

HPS OmpP2膜外结构环诱导PAMs IL- 8 mRNA转录的研究

罗银珠1，贺现辉1，周素明2，冯赛祥1，姚文凤3，徐成刚1，廖明1，辛朝安1
（1.华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点开放实验室，广东广州510642；2.宁波大学海洋科学院海洋生物应用重点实验室，浙江宁波315211；3.广东省河源市动物疫病预防控制中心，广东河源517000）

摘要：OmpP2是副猪嗜血杆菌的致病因子，也是其重要的免疫原性蛋白。为探明OmpP2蛋白8个膜外结构环（Loop）在HPS感染过程中的促炎作用，本试验以猪肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophages，PAMs）为细胞模型，以HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型标准菌株全菌体及牛血清白蛋白（BSA）作为参照，通过Real-Time PCR的方法研究OmpP2 8个膜外结构环诱导PAMs产生炎性应答的作用。结果显示，与空白对照组相比，HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白膜外结构环均能诱导PAMs细胞使其促炎细胞因子IL-8的转录水平出现不同程度的上调，表明它们在HPS感染过程中参与了宿主肺泡巨噬细胞的促炎性免疫应答；在8个膜外结构环中，Loop7（2-ΔΔCt≈8，P<0.05）表现出非常显著的刺激活性，远远高于其他膜外结构环组，并与HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白组的诱导上调幅度（2-ΔΔCt≈12（P<0.05））最接近，表明Loop7在OmpP2蛋白诱导PAMs IL-8促炎性免疫应答过程中扮演着重要角色，结果暗示Loop7很可能是OmpP2致宿主肺巨噬细胞促炎性功能活跃区。本试验为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

关键词：副猪嗜血杆菌；OmpP2；膜外结构环；猪肺巨噬细胞；细胞因子；IL-8

Corresponding author：LIAO Ming

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是猪上呼吸道的一种共栖菌，可在特定条件下引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征的猪格拉泽氏病（Glässer′s disease）[1-2]。近年来该病已成为严重影响养猪业的细菌病[3]。迄今为止，有关H.parasuis的毒力因子及致病机制尚不完全清楚并逐渐引起国际的广泛关注。

微孔蛋白（porin）存在于革兰阴性细菌外膜上的一类穿膜基质蛋白，单体分子质量为28～48 kDa，基本功能是形成非特异性亲水孔道并横跨脂质双层。国外多项研究表明，多种革兰阴性细菌的膜孔蛋白均能诱导宿主细胞产生炎性免疫应答[4-6]。在H.parasuis中,外膜蛋白P2（OmpP2）是微孔蛋白主要成员，在外膜蛋白中含量最丰富[7]。Ruiz等人推测一个36.6～38.5 kDa范围内的外膜蛋白可能与毒力存在联系[8]。赵倩等研究发现，强毒力菌株OmpP2基因序列在第450～524位以及第770～844位存在两段碱基缺失，并通过试验证明，碱基连续缺失的OmpP2基因是HPS的一个毒力基因[9-10]。近年来不断有研究表明，OmpP2是一个免疫保护性蛋白，在维持细菌生长、诱导宿主细胞免疫应答、抵抗血清中补体杀菌作用及对宿主细胞的粘附作用发挥着重要的作用[11-13]。Zhou等[14]利用运用转录组学方法证实了OmpP2蛋白参与了宿主的炎性免疫应答，但OmpP2蛋白各膜外结构环（Loop）在HPS诱发宿主产生炎症反应过程的功能域尚不清楚。本试验试图以猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为细胞模型，在体外研究PAMs受OmpP2不同膜外结构环诱导后IL-8 mRNA的转录水平，期望在分子水平角度探明OmpP2膜外结构环在HPS致炎过程中的作用，为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

1　材料与方法

1.1菌株和细胞株来源本研究所用HPS血清5型标准菌株为华中农业大学陈焕春院士惠赠；猪肺泡巨噬细胞（PAMs），购自美国ATCC（细胞编号：CRL-2845）。

1.2主要仪器及试剂荧光定量PCR仪7500型（ABI，美国）；核酸蛋白电泳仪（Bio-Rad，美国）；凝胶成像系统（TANON，中国）；胰蛋白酶、1640培养液（HyClone，美国）；RNA提取试剂TRIZol LS Reagent（Invitrogen，美国）；反转录试剂盒RT re⁃agent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex Taq（TaKaLa，日本）。

1.3热灭活HPS菌体制备及膜外结构环合成挑取HPS血清5型标准菌株单菌落在TSB肉汤中于37℃、震荡培养12 h。取合适稀释梯度的溶液涂TSA平板进行细菌计数。并取10 mL菌液离心后用PBS洗涤3次,用1 mL PBS进行重悬，于60℃灭活1 h。

所用OmpP2 Loop1～Loop8合成参考[15]，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。氨基酸序列信息详见表1。

表1　HPS血清5型标准菌株OmpP2膜外结构环的氨基酸序列

1.4副猪嗜血杆菌OmpP2提取及浓度的测定挑取单菌落进行扩大培养；离心收集菌体；TE缓冲液重悬，加入适量溶菌酶，37℃震荡30 min；再加入Mgcl2，DNAase以及RNAase，37℃震荡15 min；离心收集沉淀；用TE缓冲液洗涤沉淀，再用TEX缓冲液重悬沉淀；加入胰蛋白酶，37℃震荡1 h；离心收集沉淀；用含有0.25 % SLS的PBS溶解沉淀，10 kD孔径超滤管重复超滤3次；最后利用福林酚法测定所抽提的HPS标准5型菌株OmpP2蛋白浓度。

1.5促炎细胞因子相对定量PCR引物猪促炎细胞因子GADPH、IL-8序列参考[14]，内参选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH），引物信息见表2。

表2　猪促炎细胞因子及内参基因荧光定量PCR引物

1.6猪肺泡巨噬细胞（PAMs）的处理将胰酶消化好的PAMs细胞传至含有1640培养基的12孔培养板中，37℃、5 % CO2培养箱中培养过夜；在实验组细胞中分别加入终浓度为150 nmol/mL的Loop1～Loop8、对照组细胞组分别加入终浓度为5×108CFU/mL热灭活菌株，5 μg/mL提取纯化的OmpP2蛋白，5 μg/mL牛血清白蛋白，共孵育3 h。另设一无处理细胞作为空白对照组。

1.7细胞RNA的抽提及cDNA的合成收集经不同处理后PAMs细胞，采用TRIZol试剂（Invitrogen公司）提取各细胞株样本的总RNA，其操作步骤按产品说明书进行。RNA的反转录参照产品说明书进行。

1.8 PAMs IL-8 mRNA表达检测以实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法扩增。反应体系按照试剂盒说明书配置，PCR反应采用两步法。每个因子的检测样品重复3孔。每个样本重复3次。

1.9数据处理及统计分析最后收集数据进行2-△△CT分析，其中ΔΔCt = [Ct（c目的基因）-Ct（c内参）]-[Ct（n目的基因）-Ct（n内参）]（c:表示空白对照组，n：表示各实验组）。结果采用t检验进行差异显著性分析。

2　结果

2.1HPS血清5型标准菌株OmpP2的提取结果发现，所提取的蛋白纯度较高，经考马斯亮蓝染色后在约38 kD的位置有较为明显的蛋白条带，该蛋白的大小与OmpP2蛋白预期大小极为一致，并且肉眼未见其他蛋白的污染（图1）。利用福林酚法绘制标准曲线，最终测定所抽提的HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白浓度为1.5 μg/μL。

图1　HPS血清5型标准菌株OmpP2 SDS- PAGE

2.2RNA提取质量检验随机选取经不同处理后的猪肺泡巨噬细胞RNA样品,用核酸浓度测定仪测定样品A260/A280值均介于1.95～2.0之间,说明其纯度较好。常规核酸电泳结果如图2：所抽提的总RNA中有明显可见的28S、18S及5S（S为沉降系数）核糖体RNA条带，说明其完整性较好。

2.3细胞因子扩增特异性检测结果以反转录所得cDNA作为模板，用所设计的促炎细胞因子的引物对内参基因GADPH、IL-8进行扩增。扩增结果如图3所示，所有引物均只有1条扩增条带，扩增条带大小与预期产物大小一致。该结果显示，所设计的荧光定量引物非常特异，可用于对定量检测。

图2　抽提RNA电泳结果

图3　促炎细胞因子扩增结果

2.4Real-Time PCR测定PAMs不同诱导组IL-8转录水平结果发现与空白对照组相比HPS血清5型标准菌株全菌（2-ΔΔCt≈26）及OmpP2蛋白（2-ΔΔCt≈12）均能诱导PAMs细胞使其IL-8的转录水平显著升高（P<0.05），分别约为对照组的26倍和11倍。而在Loop1～Loop8的8个诱导组中，与空白对照组比，各个处理组的IL-8的转录水平均不同程度的上调，其中Loop1、Loop7、Loop8组的IL-8的转录水平具有显著性升高（P<0.05），分别是对照组的3、8倍和4倍，其中Loop7诱导组的IL-8的转录水平最高（2-ΔΔCt≈8），其次是Loop8组（2-ΔΔCt≈5）。值得注意的是，虽然与空白对照组在统计学上不具显著（P>0.05），Loop2组处理的PAMs细胞IL-8转录水平几乎与Loop7持平（2-ΔΔCt≈8）。在所有膜外结构环处理组中，Loop4处理组IL-8转录水平表现最低（2-ΔΔCt≈2）。

图4　HPS血清5型标准菌株不同组分刺激PAMs 3 h后IL- 8表达变化情况

3　讨论

细菌中存在多种成分可以激活宿主的炎性免疫应答，国外多项研究表明，多种革兰阴性细菌膜孔蛋白（Porin）能诱导宿主细胞产生炎性免疫应答[15-16]。当猪感染了这些病菌后，作为专职抗原递呈细胞（APC）的肺泡巨噬细胞在吞噬和处理抗原同时，也会分泌促感染细胞因子如IL-1、IL-8、抗感染因子-β及肿瘤坏死因子等，这些物质决定了免疫和炎性反应的剧烈程度。以炎症反应为主要发病特征的副猪嗜血杆菌病的发病，与猪体内过激的炎性免疫息息相关。近年来，陆续有研究表明，作为HPS膜孔蛋白主要成员的OmpP2是一个免疫保护性蛋白，在HPS感染过程中细菌生长、抵抗血清中补体杀菌作用及对宿主细胞的粘附作用发挥着重要的作用。Zhou等[14]利用运用转录组学方法证实了OmpP2蛋白参与了宿主的炎性免疫应答，但OmpP2蛋白各膜外结构环在HPS诱发宿主产生免疫应答过程中发挥的作用及功能尚不清楚。本试验试图以猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为细胞模型，在体外研究PAMs受热灭活的HPS血清5型标准菌株、提取纯化的HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型标准菌株OmpP2膜外结构环诱导后IL-8 mRNA的转录水平，期望在分子水平角度探明OmpP2不同膜外结构环在HPS促炎过程中的作用。

结果显示，在对照组里，OmpP2蛋白与HPS血清5型标准菌株全菌均能诱导PAMs IL-8转录水平的显著上调（P<0.05），证实它们对宿主细胞均具有较强的促致炎作用，这与Zhou等得到OmpP2蛋白在HPS感染过程是其重要的炎性免疫应答的激活物质的结论相吻合[14]。同等剂量下，OmpP2 8个膜外结构环诱导PAMs促炎细胞因子IL-8促炎细胞因子mRNA转录水平有不同程度上调，因此我们认为它们在HPS感染过程中参与了宿主肺泡巨噬细胞促炎细胞因子IL-8免疫应答反应；且Loop7表现出最为显著的刺激活性（P<0.05），暗示其很可能是OmpP2促炎功能活跃区。从膜外结构环序列长度与诱导活性关系分析，Loop7氨基酸长度最短只有12个氨基酸，Loop2氨基酸长度为第二短13个氨基酸，它们均表现出最为显著的刺激活性，而氨基酸序列最长的Loop3与第三长Loop4诱导PAMs细胞IL-8 mRNA转录效果不明显，暗示着膜外结构环序列长度与膜外结构环蛋白功能密切相关，这与同研究嗜血杆菌属外膜蛋白膜外结构环的Vitiello的观点一致[17]。以上结果为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

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Loops of OmpP2 Porin from HaemophilusparasuisInducesIL- 8 mRNA Expression in PAMs

LUO Yin-zhu1，HE Xian-hui1，ZHOU Su-ming2，FENG Sai-xiang1，YAO Wen-feng3，XU Cheng-gang1，LIAO Ming1，XIN Chao-an1
（1.Key Laboratory of Veterinary Vaccine Innovation of the Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Heyuan，Heyuan 517000，China）

Abstract：Outer membrane protein P2（OmpP2）is the pathogenic factor and the important immunogenicity protein of Hae⁃mophilus parasuis（HPS）.In order to study the role of loops of HPS OmpP2 porin in the inflammatory process，porcine alveolar mac⁃rophages（PAMs）was used as a cell model in the present study.Interleukin 8 IL-8 induced expression by Loop1~Loop 8 of H.para⁃suis type 5 standard strains OmpP2 in PAMs was analyzed by real-time PCR.Our result showed that，all loops of H.parasuis type 5 standard strains OmpP2 porin could trigger cytokine mRNA expression in PAMs in vitro.It demonstrated that loops of HPS type 5 standard strains OmpP2 was involved in the inflammatory reaction of the host cell.Among loops，Loop7（2-ΔΔCt≈8，P<0.05）showed⁃significant stimulation，much higher than other loops and closing to the OmpP2（2-ΔΔCt≈11，P<0.05）of HPS standard type 5 strains. These results suggest that Loop7 is likely to be an active function region of the OmpP2 porin.This study provides further under⁃standing of OmpP2 porin function.

Key words：Haemophilus parasuis；OmpP2；Loop；PAMs；IL-8

通讯作者：廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn

作者简介：罗银珠（1983-），女，兽医师，硕士，从事动物疾病研究工作，E-mail：agluo122@sina.com

基金项目：农业部公益性行业科研专项经费项目（20130303-4）；农业科研杰出人才及其创新团队-现代农业人才支撑计划项目[农财发（2012）160号]；教育部博士点基金项目（201144041100-16）

收稿日期：2014-05-23

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0003- 04