回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元、基质金属蛋白酶-14、内皮抑素及血管内皮生长因子在喉癌中的表达及相关性研究

左文娜（河北省沧州市中心医院耳鼻咽喉科，河北沧州061001）

回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元、基质金属蛋白酶-14、内皮抑素及血管内皮生长因子在喉癌中的表达及相关性研究

左文娜
（河北省沧州市中心医院耳鼻咽喉科，河北沧州061001）

摘要：目的观察回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元（RECK）、基质金属蛋白酶-14（MMP-14、）、内皮抑素（Endostatin）及血管内皮生长因子（VEGF）在喉癌中的表达，并对其相关性进行分析。方法应用流式细胞检测仪检测40例喉癌患者的喉癌组织（喉癌组）、癌旁组织（癌旁组）及喉部正常黏膜组织（对照组）中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表达水平，并统计分析其表达与喉癌临床病理因素的关系及其之间的相关性。结果在喉癌组织中，RECK、Endostatin的蛋白FI表达量显著低于癌旁组及对照组（P<0.05）；MMP-14及VEGF蛋白的FI表达量显著高于癌旁组及对照组（P<0.05）。喉癌组织中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表达量与喉癌组织的转化程度、是否发生淋巴结转移及临床分期病理组织学分级密切相关（P<0.05），但与年龄的关系不密切（P>0.05）。表达相关性结果显示，喉癌组织中RECK与MMP-14表达呈负相关（r= -0.765，P<0.03），喉癌组织中Endostatin与VEGF蛋白的表达呈负相关（r =-0.563，P<0.04）。结论RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF有可能参与喉癌的发生、发展、分化及转移，并呈现出一定的相关性，联合检测RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表达，可能有利于临床对喉癌的诊断。

关键词：喉癌；回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元；基质金属蛋白酶-14；内皮抑素；血管内皮生长因子

近年来，喉癌的发病率持续升高，成为耳鼻喉科最常见的肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1.2%～1.6%。随着现代技术的进步，对喉癌的癌基因、抑癌基因、细胞周期调控因子、表面受体等变化及其涉及的信号转导和效应都有进一步的认识，为喉癌的临床诊断及治疗提供新的思路。本文采用流式细胞仪检测与肿瘤密切相关的癌症基因[回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元（reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs，RECK）]、基质金属蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）、内皮抑素（Endostatin）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）]在喉癌组织中的表达，并与癌旁组织及喉部正常黏膜组织比较，探讨其与喉癌发生、发展、浸润及转移的关系，并进行相关性分析，为临床喉癌的诊断提供新思路。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2010年2月-2013年9月在河北省沧州市中心医院耳鼻咽喉科手术切除，并经病理检测证实为喉鳞癌的患者40例，包括该患者的喉癌组织（喉癌组）、癌周围组织（癌旁组）及喉部正常黏膜组织（对照组）。其中喉癌组中男性28例，女性12例；年龄（51.25±4.83）岁；高分化25例，中分化10例，低分化5例；其中伴有淋巴结转移29例。根据国际抗癌协会TNM分类临床分期标准，Ⅰ、Ⅱ期17例，Ⅲ、Ⅳ期23例；所有患者术前经过放疗、化疗。本研究所有入选患者签署知情同意书，并经本院伦理委员会批准。

1.2实验方法

1.2.1制备单细胞悬液将0.5 g组织放置于120目的不锈钢网上剪碎，用0.9%氯化钠溶液及镊子轻轻搓洗至其自然沉淀，收集细胞悬液。混悬液过滤，除去细胞团块。1 000 r/min离心3 min，弃上清液。加入1 ml磷酸盐缓冲液制成单细胞悬液，记数并调整细胞浓度为5×106个/ml，此液为单分散细胞悬液。1.2.2细胞免疫荧光标记取1×106个细胞约0.1ml上述液体，按1∶100的浓度分别加入0.1 ml的 RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF抗体工作液（购自北京博奥森生物技术有限公司），加入磷酸盐缓冲液10 ml，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液，常温孵育30 min，避光，荧光染色。去除未结合荧光二抗。

1.2.3流式细胞仪检测条件及参数采用Epics-XLⅡ型流式细胞仪（美国Beckerman Coulter公司），15 mW氩离子激光器激光源，激发波长为488 nm，应用Expo 32ADC软件进行免疫荧光数据分析，检测前以flow-check TMF lour Pheres（10μm）荧光微球作为标准样品调整仪器CV值<2%。

1.2.4结果判定RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF表达的定量分析，按照Morkve提出的荧光指数（propidium iodide，PI）表示RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF表达的相对含量，PI=实验样品的均道值/正常组织样品的均道值（均道值=logx-Mode× 340）。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析；RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白中FI表达量与临床因素的关系用直线相关及回归分析，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表达量比较

对不同组织进行流式细胞检测。喉癌组织RECK、Endostatin蛋白中FI表达量显著低于癌旁组及对照组（P<0.05）；MMP-14及VEGF蛋白中FI表达量显著高于癌旁组及对照组（P<0.05）。见图1～4和表1、2。

2.2喉癌组织中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表达量与临床因素的关系

通过分析喉癌组织中RECK、MMP-14、Endostatin 及VEGF蛋白的FI表达量与临床因素的关系发现，RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表达量与喉癌组织的转化程度、是否发生淋巴结转移及临床分期密切相关（P<0.05），但与年龄无明显相关性（P>0.05）。见表3、4。

2.3喉癌组织中RECK、MMP-14、Endostatin及 VEGF表达的相关性分析

图1　各组Endostatin的表达

图2　各组MMP-14的表达

图3　各组RECK的表达

图4　各组VEGF的表达

喉癌组织中RECK、MMP-14、VEGF的表达呈负相关（r1=-0.765，P1<0.03；r2=-0.661，P2<0.04），喉癌组织中RECK与Endostatin的表达呈正相关（r=0.765，P<0.01）；喉癌组织中MMP-14与Endostatin的表达呈负相关（r=-0.365，P<0.03）；MMP-14与VEGF的表达呈正相关（r =0.335，P<0.03），喉癌组织中Endostatin与VEGF表达呈负相关（r=-0.563，P<0.04）。

表1　各组RECK、MMP-14蛋白中FI表达量的比较（n=40±s）

表1　各组RECK、MMP-14蛋白中FI表达量的比较（n=40±s）

注：与癌旁组和对照组比较，P<0.05

组别　RECK蛋白中FI表达量　P值　MMP-14蛋白中FI表达量　P值喉癌组　0.698±0.109　0.017　1.775±0.165　0.024癌旁组　0.889±0.155　0.034　1.246±0.157　0.037对照组　0.963±0.114　0.021　1.097±0.276　0.017

表2　各组Endostatin、VEGF蛋白中FI表达量的比较（n=40±s）

表2　各组Endostatin、VEGF蛋白中FI表达量的比较（n=40±s）

注：与癌旁组和对照组比较，P<0.05

组别　Endostatin蛋白中FI表达量　P值　VEGF蛋白中FI表达量　P值喉癌组　1.115±0.113　0.011　3.179±0.154　0.024癌旁组　2.987±0.215　0.031　2.243±0.221　0.041对照组　3.336±0.112　0.013　2.067±0.189　0.032

表3　喉癌组织中RECK、MMP-14的FI表达量与临床因素的关系（±s）

表3　喉癌组织中RECK、MMP-14的FI表达量与临床因素的关系（±s）

组别　年龄/岁≤50（n=15）>50（n=25）　低（n=5）　否（n=11）分化程度高（n=25）　中（n=10）是否转移是（n=29）临床分期Ⅰ、Ⅱ期（n=17）Ⅲ、Ⅳ期（n=23）RECK中FI表达量　1.113±0.154 1.212±0.123 1.3778±0.215 1.263±0.123 1.106±0.111 1.341±0.212 1.032±0.017 1.034±0.013 0.712±0.021 P值　0.678　0.023　0.035　0.023 MMP-14中FI表达量　3.156±0.114 3.179±0.115 3.389±0.322 3.287±0.213 3.018±0.117 3.372±0.116 3.008±0.113 1.432±0.112 1.811±0.121 P值　0.677　0.043　0.043　0.012

表4　喉癌组织中Endostatin、VEGF的FI表达量与临床因素的关系（±s）

表4　喉癌组织中Endostatin、VEGF的FI表达量与临床因素的关系（±s）

组别年龄/岁≤50（n=15）>50（n=25）　低（n=5）　否（n=11）分化程度高（n=25）　中（n=10）是否转移是（n=29）临床分期Ⅰ、Ⅱ期（n=17）Ⅲ、Ⅳ期（n=23）Endostatin中FI表达量　0.613±0.134 0.712±0.122 0.778±0.015 0.663±0.123 0.606±0.111 0.734±0.212 0.632±0.016 1.027±0.117　1.332±0.218 P值　0.678　0.034　0.045　0.011 VEGF中FI表达量　1.756±0.114 1.789±0.115 1.889±0.322 1.789±0.223 1.698±0.112 1.897±0.116 1.698±0.112 1.734±0.011　1.332±0.117 P值　0.677　0.033　0.013　0.016

3　讨论

本实验发现，在喉癌组织中，RECK、Endostatin的FI表达量显著低于癌旁组及对照组（P<0.05）；而MMP-14及VEGF蛋白中FI表达量相反（P<0.05）；且RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的FI表达量与喉癌组织的转化程度、发生淋巴结转移及临床分期、病理组织学分级密切相关（P<0.05）；喉癌组织中RECK与MMP-14、Endostatin与VEGF表达呈负相关（r1=-0.765，r2=-0.563，P<0.05）。

RECK可以抑制肿瘤的浸润转移和血管生成，并有抑制基质金属蛋白表达与活性的功能。多项研究发现，RECK蛋白在癌组织中低表达，表明该组织具有较严重的浸润性，患者的生存率更低[1-2]。而XU 等[3]证实RECK基因在骨肉瘤的高转移组中低表达，在低转移组中高表达。结果提示，RECK蛋白表达的变化可能与肿瘤的发展、转移密切相关。

MMPs家族为降解细胞外基质的主要酶类，在肿瘤发生、发展及浸润转移过程中具有重要意义。而MMP-14蛋白可以启动细胞表面多个蛋白级联反应，直接降解与破坏肿瘤患者的细胞外基质和基底膜，打破阻挡肿瘤细胞因子浸润的屏障[4-5]。ULASOV 等[6]研究发现，运用替莫唑胺与紫外疗法治疗后，胶质瘤模型老鼠的MMP-14蛋白表达量显著降低，提示临床上可以通过抑制MMP-14表达量来治疗胶质瘤。

VEGF是最具有特异性的肿瘤血管形成因子，可刺激血管内皮细胞，促进血管生长，增加微血管通透性，为肿瘤细胞生长及转移提供良好的内环境[7-8]。YOKOYAMA等[9]研究证实胃癌组织中VEGF-A及VEGF-C呈现高表达，其表达降低则会抑制肿瘤的增殖及扩散，这与本研究结果相一致。

Endostatin因具有抑制血管内皮因子生长的作用而受到众多学者青睐。Endostain可以特异性地作用于血管内皮因子，显著抑制其增殖和迁移，阻滞血管内皮因子的细胞周期，引起凋亡，进而抑制癌症的发展及扩散[10]。诸多研究表明肿瘤的发生与Endostain的低表达密切相关[11-12]。

综上所述，RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF与喉癌发生、发展、浸润及转移呈现出一定的相关性，临床上可联合检测其表达水平，为喉癌的诊断治疗提供新思路。

参考文献：

[1] CLARK JC, THOMAS DM, CHONG PF, et al. RECK-a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2007, 26(3/4): 675-683.

[2] TAKEMOTO N, TADA M, HIDA Y, et al. Low expression of reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs (RECK) indicates a shorter survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung[J]. Lung Cancer, 2007, 58(3): 376-383.

[3] XU L, YANG SH, LIU GJ, et al. Expression of RECK gene in the osteosarcoma cell line and its correlation with MMP- 2[J]. Chinese German Journal of Clinical Oncology, 2009, 8(5): 289-291.

[4] ASANO T, TADA M, CHENG SQ, et al. Prognnostic values of matrix metalioproteinase family expression in human colorectal carcinoma[J]. Journal of Surgical Research, 2008, 146(1): 32-42.

[5] WANG AX, ZHANG B, HUANG HZ, et al. Suppression of local invasion of ameloblastoma by inhibition of matrix metalloproteinase-2 in vitro[J]. BMC Cancer, 2008, 8: 182-185.

[6] ULASOV I, THACI B, SARVAIYA P, et al. Inhibition of MMP-14 potentiates the therapeutic effect of temozolomide and radiation in gliomas[J]. Cancer Med, 2013, 2(4): 457-467.

[7]李伟,张华东,李自强,等. VEGF、HIF-1α在不同前列腺病变组织中的表达及临床意义[J].解放军医药杂志, 2012, 24(5): 11-13.

[8]李光明,段百芸.乳腺癌组织VEGF-D表达及淋巴管生成的临床意义探讨[J].中华肿瘤防治杂志, 2010, 7(13): 1004-1007.

[9] YOKOYAMA Y, RAMAKRISHNAN S. Addition of an aminopeptidase N-binding sequence to human endostatin improves inhibition of ovarian carcinoma growth[J]. Cancer, 2005, 104(2): 321-331.

[10] HU MM, HU Y, ZHANG HQ, et al. Clinical significance of serumand tumor tissue endostatin evaluation in operable non-small cell lung cancer[J]. Biomedical Reports, 2014, 2(6): 898-904.

[11] ZHANG Q, DU Y, XUE ZW, et al. Comprehensive evaluationofthe anti-angiogenic and anti-neoplastic effects of endostar on liver cancer through optical molecular imaging[J]. PLoS One, 2014, 9(1): DOI:10.1371/Journal.pone.0085559.

[12]牟海军,徐靖宇,谢睿,等. VEGF、Endostatin、Endothelin-1在大肠腺瘤及大肠癌中的表达及意义[J].中国现代医学杂志,2014,24(16): 19-24.

（童颖丹编辑）

·新进展研究·

Expressions of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF in laryngeal cancer and their correlations

Wen-na ZUO
(Department of Otolaryngology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou, Hebei 061001, P.R. China)

Abstract:【Objective】To investigate RECK, MMP-14, endostatin and VEGF expressions in laryngeal cancer, and to analyze their correlations.【Methods】Using flow cytometry, the laryngeal cancer tissue (cancer group), tissue adjacent to carcinoma (pericancer group) and normal laryngeal mucosa tissue (control group) were detected in 40 laryngeal cancer patients for the expression levels of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF. The relations between their expressions and the clinical pathologic factors of laryngeal cancer were statistically analyzed.【Results】Flow cytometry showed the FI expression levels of RECK and endostatin in the cancer group were significantly lower than those in the pericancer group and control group (P< 0.05); the FI expression levels of MMP-14 and VEGF proteins in the cancer group were significantly higher than those in the pericancer group and control group (P < 0.05). The FI expression levels of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF in laryngeal cancer tissues were closely correlated with differentiation of laryngeal cancer, occurrence of lymphatic metastasis and clinicopathological stage (P< 0.05), but not correlated with the age (P> 0.05). In the laryngeal cancer tissue, RECK expression was negatively correlated with MMP-14 (r = -0.765, P< 0.05), andbook=72,ebook=78endostatin expression was negatively correlated to the expression of VEGF (r = -0.563, P<0.05).【Conclusions】RECK, MMP-14, endostatin and VEGF are likely to be involved in the occurrence and development of laryngeal cancer, in the process of differentiation and metastasis, and have certain correlations. The joint detection of RECK, endostatin, VEGF and MMP-14 may help clinical diagnosis of laryngeal cancer.

Key words:laryngeal cancer; RECK; MMP-14; endostatin; VEGF

收稿日期：2014-11-11

文章编号：1005-8982（2015）23-0071-05

中图分类号：R739.65

文献标识码：A